枯草芽孢杆菌常用培养基的配制方法;

1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+20g琼脂 

枯草芽孢杆菌原生质体的制备  

1 培养枯草芽孢杆菌  
取亲本菌株T4412、TT2 新鲜斜面分别接一环到装有液体*培养基（CM）的试管中，36℃振荡培养14 h，各取1 mL 菌液转接入装有20 mL 液体*培养基的250 mL 锥形瓶中，36℃振荡培养 3 h，使细胞生长进入对数前期，各加入25 u/mL *，使其终浓度为0.3 u/mL，继续振荡培养2 h。  

 2. 收集细胞  
各取菌液10 mL，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心。如此洗涤两次，将菌体悬浮10 mL SMM 中，每mL 约含108～109 活菌为宜。  

3. 总菌数测定  
各取菌液0.5 mL，用生理盐水稀释，取10-5、10-6、10-7 各1mL（每稀释度作两个平板）、倾注*培养基，36℃培养24 h 后计数。此为未经酶处理的总菌数。  
    4. 脱壁  
    二株亲本菌株各取5 mL 菌悬液，加入5 mL *溶液，*浓度为100 ug/mL，混匀后于36℃水浴保温处理30 min，定时取样，镜检观察原生质体形成情况，当95%以上细胞变成球状原生质体时，用4000 r/min 离心10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮于5 mL 高渗缓冲液中。立即进行剩余菌数的测定。  

5. 剩余菌数测定  
    取0.5 mL 上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取10-2、10-3、10-4 稀释液各0.1 mL，涂布于*培养基平板上，36℃培养24～48 h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。  
    计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。原生质体形成率＝未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数。