不同相对分子质量蛋白质的分离—凝胶柱层析法
目的要求
（1）、了解凝胶柱层析的原理及应用
（2）、掌握凝胶柱层析的基本操作技术
实验原理
凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按相对分子质量大小分流物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此比较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此，就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以*或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关。
在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物相对分子质量的变化而变化的。分离物相对分子质量大，Kav值小；反之则Kav值增大。
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质相对分子质量大，呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被*排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测。但是，在测定激酶等蛋白质的相对分子质量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。测定内水体积（Vt）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰*乙酯，或者其他与凝胶无吸附力的小分子物质。
本实验使用血红蛋白和二硝基氟苯—*的混合物，通过Sephadex G-25层析后达到分离。
试剂和器材
（1）、试剂
0.9%NaCI；10%NaHCO3；95%乙醇。pH7.0凝酸缓冲液。
（2）、材料
血红蛋白溶液（Hb）；取抗凝血（肝素）2mL，离心弃去上层血浆。用0.9%NaCI洗血细胞数次，使离心后上清液几乎无淡黄色为止。于洗净的红细胞中加入5倍体积的蒸馏水摇匀，离心去沉淀即为Hb稀释液备用。
DNP-*溶液：取*0.15g溶于10%NaHCO3溶液1.5mL中。另取二硝基氟苯0.15g，溶于微热的95%乙醇3mL中，待其充分溶解后立即倾入上述蛋白质溶液中。将此管置于沸水浴中煮沸5min，注意防止乙醇沸腾溢出。冷却后加2倍体积的95%乙醇，可见黄色的DNP-*沉淀。离心(300r/m)5min,弃去上清液，沉淀用95%乙醇洗2次，所得沉淀用1mL蒸馏水溶解，即为DNP-*溶液，备用。
（3）、器材
层析柱（1cm×15cm）；吸管1mL（×1）；滴管；搅棒试管。
操作方法
（1）、凝胶的溶胀
取3g葡聚糖凝胶干粉，浸泡于蒸馏水中充分溶胀，或者于沸水浴中煮沸1h后冷却。充分溶胀后的凝胶以倾斜洗除去表面悬浮的小颗粒，如此反复洗涤2～3次，zui后加入等体积pH7.0磷酸缓冲液备用。
（2）、装住
取直径1cm，长15cm的玻璃层析柱，垂直固定在铁架台上，将层析柱下端的止水螺丝旋紧，向柱中加入5～7cm高的磷酸缓冲液，调节流速1滴/10s。待柱中剩下约0.5cm磷酸缓冲液时，关掉恒流泵，把溶胀好的糊状凝胶一次性倒入柱中，自然沉降20min。在此过程中可以看到凝胶均匀地沉降到柱的底部并不断地上升。20min后，用镊子小心地在胶面上放置圆片滤纸，用滴管补加缓冲液。同时开启恒流泵，控制一定的流速，使柱中的凝胶一直处在溶液中。若分次装入凝胶，需要玻璃棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面分层。装柱长度至少10cm。
（3）、平衡
用磷酸缓冲液冲洗洗脱，平衡20min。注意在任何时候不要使液面低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动。
（4）、样品制备
取DNP-*溶液3滴和Hb溶液1滴混合，即为上柱样品。
（5）、上样
待层析柱上缓冲液几乎全部进入凝胶时，关掉恒流泵，用滴管将上述样品沿柱内壁小心加到床表面，注意尽量不使平整的床表面搅动，然后打开恒流泵，让样品进入柱床。待其将进入柱床时，关掉恒流泵，用滴管小心加入磷酸缓冲液至柱顶。
（6）、洗脱
旋紧柱顶，将进液管接入洗脱液瓶中，用缓冲液进行洗脱，控制缓冲液在约每10s一滴的流速，观察并记录Hb和DNP-*在层析柱中的位置，并解释之。
待所有有色条带*流出柱子后，继续洗柱5min。停止恒流泵，卸下柱子，旋下柱顶螺旋，将凝胶倒回小烧杯中并取出滤纸片。
注意事项
（1）、根据层析柱的溶剂和所选用的凝胶溶胀后柱床容积，计算所需凝胶干粉的重量，用洗脱缓冲液使其充分溶胀。
（2）、层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据试剂需要选择。一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多，选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径太小时，会发生“管壁效应”，即柱管中心部分的组分移动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。
（3）、各接头不漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则容易造成漏气、漏液。
（4）、装柱要均匀，不要过松也不要过紧，也在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。但也不要过慢，使柱装的太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。
（5）、始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。
