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重组DNA分子电转化入宿主细胞

阅读:387发布时间:2016-7-11

重组DNA分子电转化入宿主细胞

 

实验原理

宿主细胞是基因克隆载体的增殖场所,对于一个适当的宿主细胞,具有以下几个要求:

1、对载体的复制和扩增没有严格的限制。

2、不存在特异的内切酶体系降解载体DNA。

3、载体增殖过程中,不对载体DNA进行修饰。

4、不会生产载体DNA的体内重组。

5、容易导入重组DNA分子。

6、符合“重组DNA操作规则”的安全标准。

现在常规使用的是大肠肝菌XL1-Blue株K12株。本实验用XL1-Blue株。

试剂和器材

备用平板,冰盒,20uL枪,未开盖的新枪头盒。

重组DNA。

氨苄青酶素(AP)。

二甲苯甲酰胺(X-gal  20mg/mL,溶于二甲苯甲酰胺,无须滤过灭菌,分装小包装避光贮存于—20℃)。

IPTG。

XL1-Blue电击细胞。

操作方法

1、铺备用平板

    LB固体培养基200mL,融化后加200uL。→凝固后约半小时,加入X-gal  80uL和IPTG  9uL。→涂布,37℃,约1h。→得备用平板。

2、电击转化

    电击法依靠短暂的电击,促使DNA进入细菌。—70℃冰箱取电击细胞XL1-Blue,冰上解冻。→取2uL重组DNA或链接产物于40uL电击细胞中,混匀。→在电击仪上将重组DNA分子转入XL1-Blue细胞。→恢复生长约半小时。→1200r/min,2~3min。→去掉大部分上清,剩200~300uL,用枪吹打混匀。→涂布备用平板。→37℃,培养过夜。→挑白色菌落。


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