免疫荧光标本的特殊处理技术
死细胞及碎片的去除 由于标本送检时间、实验操作等都会造成部分细胞死亡。为保证结果准确，尤其是细胞或亚群的测定，应当排除死亡细胞，不然这些细胞含特异结合抗体，干扰免疫荧光分布；不完整的死细胞碎片也可贴附到活细胞上，影响DNA或免疫荧光的分布。排除方法根据细胞样品而定，血细胞大小基本均匀一致，可根据死细胞低强度的前向角散射而同活细胞分开。但培养细胞大小分布不均，大量的死亡细胞因体积缩小，其前向角散射可能同小细胞重叠起来难以鉴别，可采用样品内加入少量PI，使死亡细胞的DNA染色而加以排除。
过多的碎片也会影响测定的准确性。为去掉碎片，可在盛1ml血清的试管内，重层细胞悬液1—2ml在血清上，15分钟直立后，大的碎片自行现于管底，再把悬液移至另一含血清试管内，离心。此时细胞留于血清内，小碎片在血清上层。去掉上层，并向含细胞的血清内加入培养基，洗标本数次，待测。一般情况下，可直接用仪器的处理排除碎片，避免繁琐的操作。
染色中膜能量转移的预防 由于细胞膜机构的特殊性，在染色处理时会发生能量转换，蛋白质、糖蛋白及类脂双层等膜成分的动力学改变，从而形成三种现象：*是足够浓度的多价抗体或单价的Fab片段，用于染色时可见到随机分布的膜反应—均匀的环形，这种现象也同细胞结构有关；第二种现象是点状（Spot）分布或：“补丁”（Patches）状的荧光分布，多发生在低浓度二价或多价抗体染色时。它实际是表面抗原的重新分配过程—被动凝聚现象，这种现象在体内也会发生，冷环境，NaN3，不会制止它的出现；第三种是帽形成，是细胞膜物质半月形分配，点状或“补丁”状可能是帽现象的前提。帽形成多发生在细胞高尔基体附近的特殊极点，是一种细胞生理现象。冷环境、NaN3等封闭代谢作用的物质或条件可使其抑制。因此，为了保证细胞免疫荧光测定的和稳定，实验操作应尽量在冷环境中进行，使用的缓冲液系统补加叠氮钠。
标本的保存和固定 试验中，尤其是临床标本，有时要保存一定时间。未染色的新鲜标本可用以下方法贮存：10%二甲基亚砜，90%小牛血清，5×106—1×107细胞，—70℃过夜，然后置液氮内，可较长期保存。亦可把细胞放于50%A、B型混合血清的RPMI 1640培基内，4℃10分钟，再缓慢加入等量20%二甲基亚砜 A、B/RPMI 1640液，放液氮气相，再转入液相。此种冷冻方法，在1个月内染色的细胞群体比例不发生大的改变。也有人用20%小牛血清RPMI 1640，,10%二甲基亚矾保存细胞，—10℃过夜，转入液氮内，保存时间5天。
免疫荧光染色的标本如不能立即测定、或标本具有传染性，应做标本固定。未固定的标本，一般在4℃可放48小时，过时将会发生细胞劈裂或荧光色素内化，群体比列发生明显变化。对固定的方法要求应当是：1、固定程序简单，试剂单一；2、固定不明显影响细胞体积、光扫描结果及荧光特性；3、固定后必须能保存一定时间，任何染色前固定都不适用于免疫荧光染色。
常用试剂 甲醛是zui常用的理想药品，它不但有固定膜蛋白的能力，而且可以杀灭样品中的微生物，尤其当代HIV-I病毒的感染。一般以1—4%多聚甲醛—PBS，pH7.2固定液，或用0.37—1.5%甲醛—PBS pH溶液。在免疫胶体金标本固定时，常用PLP液，其组成为1%多聚甲醛pH7.3水液加9mg对位过碘酸加3ml 0.1M L-赖氨酸0.1M PBS。100%甲醇固定液荧光效果理想，但细胞易凝聚成团。50、70、100%乙醇或乙醇：甲醇混合液效果均不理想。
固定方法 经免疫荧光染色后，离心沉淀细胞，加入固定液混匀，放4℃保存。分析时可直接应用或洗一次测定。如同时做DNA染色，可固定4小时，加入DNA染料，或在固定后加入70%乙醇，使细胞膜渗透性增加。实践证明，固定保存1周至2个月，多数标本阳性细胞群体比例及荧光强度均在正常范围内，特别是前向角散射扫描显示细胞大小分布规律更佳。但要注意细胞膜经固定后通透性增加，在做免疫荧光双染色时管道内红色荧光颜料的污染，造成红荧光群体增加的假象。
