Ca++ Mg++- ATP 酶活性测定说明书
分光光度法 50 管/24 样
测定意义：
Ca++ Mg++-ATP 酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化 ATP 水解生成 ADP 和无机磷。
测定原理：
根据 Ca++ Mg++-ATP 酶分解 ATP 生成 ADP 及无机磷，通过测定无机磷的量来确定 ATP 酶活性高低。
需自备的仪器及用品:
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液： 液体 50mL ×1 瓶，4℃保存。试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。试剂二：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。试剂三：液体 5ml×1 瓶，4℃保存。
试剂四：粉剂×3 支，-20℃保存。用时每支加 1mL 蒸馏水，现用现配。用不完的试剂-20℃可保存一周。
试剂五：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。
试剂六：粉剂×1 瓶，4℃保存。用时加入 3mL 蒸馏水， 4℃保存。
试剂七：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃保存一周。试剂八：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃保存一周。试剂九：液体 25mL×1 瓶，室温保存。
试剂十：10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。
0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂十 20 倍稀释，即取 0.1mL 试剂十加 1.9mL 蒸馏水充分混匀。
定磷剂的配制：按 H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
样品酶液的制备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。2、血清（浆）样品：直接检测。
操作步骤：
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 660nm，蒸馏水调零。
2、酶促反应（在 EP 管中加入下列试剂）
| | 对照管 | | | 测定管 | | |
| | | | | | | | |
试剂一（μL） | | 130 | | 90 | | |
| | | | | | | | |
试剂二（μL） | | 40 | | 40 | | |
| | | | | | | | |
试剂三（μL） | | 40 | | 40 | | |
| | | | | | | | |
试剂四（μL） | | 40 | | 40 | | |
| | | | | | | | |
试剂五（μL） | | | | 40 | | |
| | | | | | | | |
样本 （μL） | | | | 200 | | |
| | | | | | | | |
混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）准确水浴 10min | | |
试剂六（μL） | | 50 | | 50 | | |
样本 （μL） | | 200 | | | | | | |
| 混匀，8000g，常温离心 10min，取上清液 | | |
3 定磷（1.5mLEP 管中依次加入下列试剂） | | | | | | |
| | 空白管 | 标准管 | | 对照管 | | 测定管 | |
| | | | | | | |
0.5μmol/ml 标准磷应用液（μL） | | 100 | | | | | |
| | | | | | | |
上清液（μL） | | | | 100 | | 100 | |
| | | | | | | |
蒸馏水（μL） | 100 | | | | | | |
| | | | | | | |
定磷试剂（μL） | 1000 | 1000 | | 1000 | | 1000 | |
| | | | | | | | |
混匀，37℃水浴 30 min，冷却至室温，在 660nm 处比色。注意事项：
1、由于每一个样都必须做对照，本试剂盒 50 管只能测 24 份 Ca++ Mg++-ATP 酶。2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。避免磷污染是检测成败的关键。
3、空白管和标准管只要做一管。
计算
1、血清（浆）Ca++ Mg++- ATPase 活力的计算:
定义：规定每小时每毫升血清（浆）中 Ca++ Mg++- ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP 酶活力（U/mL）=[ C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A
空白管）÷V 样÷T=7.5×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）组织中 Ca++ Mg++- ATPase 的计算：
2、组织、细菌或细胞中 Ca++ Mg++- ATPase 活力的计算：（1）按蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白中 Ca++ Mg++- ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/ mg)=[C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷（V 样×Cpr）÷T =7.5×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
定义：每小时每克组织中 Ca++ Mg++-ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/g)= [C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷(W× V 样÷V 样总)÷T=7.5×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
定义：规定每小时每 1 万个细菌或细胞中 Ca++ Mg++-ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/104)= [C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.015×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）
C 标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V 总：酶促反应总体积，0.5mL；V 样：加入样本体积，0.2mL ；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1/6 小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
