辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒说明书
测定意义：
辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD 是糖酵解和 TCA 循环的主要氢受体，生成的 NADH 经呼吸电子链传递把电子交给氧，在合成 ATP 的同时，形成大量的 ROS，同时 NADH 再生为 NAD。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD 比值的高低可用于评价糖酵解和 TCA 循环的强弱。较高的 NAD(H)及 NADH/NAD 比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态，NADH/NAD 比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循环。另外，NAD 降解产物具有非常重要的调控作用。
测定原理：
NAD 和 NADH 在 254 nm 下有吸收峰，利用液相色谱法在相应波长下测定其含量。
需自备的仪器和用品：
液相色谱仪、低速离心机、溶剂抽滤装置、针头式过滤器（水系，50 个，0.22μm）、滤膜（水系和有机系各 2 个，0.45μm）、C18 柱（4.6 ×150 mm）、可调式移液器、样品瓶（50个，2mL）、乙腈（120 mL）、甲醇（色谱级，300 mL）、蒸馏水
注：若用自动进样器，需要样品瓶，测定时将不少于 1mL 的样品或标准品加入样品瓶中。无自动进样器，需手动进样时，不需要样品瓶，用进样针将不少于 20ul 的样品或标准品打入进样阀。
试剂的组成和配制：
试剂一：粉剂 1×1 瓶，粉剂 2×1 瓶，4℃保存；临用前用少量蒸馏水将粉剂 1 和粉剂 2 溶解后倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至 100mL，形成 NAD 和 NADH 提取液（注：试剂瓶中的粉剂要冲洗干净），4℃保存 3 个月；
试剂二：粉剂 1×1 瓶，粉剂 2×1 瓶，粉剂 3×1 瓶，4℃保存；临用前用少量蒸馏水将粉剂1、粉剂 2 和粉剂 3 溶解后倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至 1000mL，形成流动相缓冲液基质（注：试剂瓶中的粉剂要冲洗干净）, 4℃保存 3 个月。
试剂三：NAD 标准品 5mg×1 支，-20℃保存。加入 1mL 试剂一，配成 5mg/mL 溶液，现配现用，用不完的试剂-20℃保存。
试剂四：NADH 标准品5mg×1 支，-20℃保存。加入1mL 试剂一，配成 5mg/mL 溶液，现配现用，用不完的试剂-20℃保存。
实验前的准备工作：
- 将蒸馏水 1000 mL、流动相缓冲液基质 1000 mL、甲醇 300 mL 和乙腈 120 mL 用0.45 μm 的滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱。（注：蒸馏水和缓冲液基质用水系滤膜抽滤，乙腈用有机系滤膜抽滤）。
- 流动相的配制：将抽滤完毕的流动相缓冲液基质 1000 mL 与乙腈配比为 9：1（v/v），即取 900mL 缓冲液基质与 100 mL 乙腈混合。[每个样品需要约 12mL 流动相，流动相用量（mL）=12mL×样品数量+跑基线用量（约 50mL），流动相的用量请根据样品数量用多少配多少]。
- 将抽滤完毕的甲醇和蒸馏水配比成 100%的甲醇， 10%的甲醇，蒸馏水各 250 mL。
- 将 2 和 3 中的溶剂超声 30min，以脱去溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱。
辅酶ⅠNAD(H)的提取：
组织处理：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一，提取 NAD 和 NADH，20000 g，4℃离心 30 min，取上清液用 0.22μm 水系针头式过滤器过滤后待测。
细胞处理：收集于 60 mL 细胞，离心菌体经高压冷冻干燥 12 h 后，加入 2 mL 试剂一。超声破壁细胞(950 W，30%，15 min，工作 1 s，间隔 2 s)，再经 10000 g 4℃离心 40min，上清用 0.22μm 水系微孔滤膜过滤后直接上柱检测。
辅酶ⅠNAD(H)含量测定操作步骤：
- 开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开 empower 软件，在方法组中设置进样 量20μL，流速 0.8 mL/min，保留时间 15min，检测波长 254nm,设置完毕保存方法组。
- 用 100%的甲醇、10%的甲醇、蒸馏水按甲醇浓度从大到小的顺序洗色谱柱 30min。
- 用流动相洗柱子，待基线稳定后开始加样。
- 加入标准品 20 μL，在 15min 内可分离 NAD 和 NADH， NAD 的保留时间在 3min左右，NADH 的保留时间在 7min 左右（柱子不同，保留时间有差异），计算不同浓度的 NAD 和 NADH 标准品的峰面积。
- 加入样品 20 μL，在相应保留时间处检测 NAD 和 NADH 的峰面积。
辅酶ⅠNAD(H)含量的计算：
- NAD 含量的计算
NAD 标准曲线的绘制：
将5mg/ml 的 NAD 标准品用蒸馏水分别稀释成 110 μg/ml、80 μg/ml、50 μg /ml、和 20 μg /ml 的 NAD 标准品溶液，计算不同标准品溶液的峰面积。
计算标准曲线公式为: y = 25069χ- 26754（χ为 NAD 浓度，μ g/ml；y 为峰面积）
推出：χ=（y + 26754）÷25069（χ为 NAD 浓度，μ g/ml；y 为峰面积） NAD 含量（μg/mg prot）=（样品峰面积+26754）÷25069÷蛋白浓度（mg/mL） NAD 含量（μg/g mass）=（样品峰面积+26754）÷25069÷样本鲜重（g/mL）
- NADH 含量的计算
NADH 标准曲线的绘制：
将 5mg/ml 的 NADH 标准品用蒸馏水分别稀释成 200 μg/ml、150 μg/ml、100 μg/ml 和50 μg/ml 的 NADH 标准品溶液，计算不同标准品溶液的峰面积。
计算标准曲线公式为: y = 13275χ+35717（χ为 NADH 浓度，μ g/ml；y 为峰面积）
推出：χ=（y – 35717）÷13275（χ为 NADH 浓度，μ g/ml；y 为峰面积） NADH 含量（μg/mg prot）=（样品峰面积 - 35717）÷13275÷蛋白浓度（mg/mL） NADH 含量（μg/g 鲜重）=（样品峰面积 - 35717）÷13275÷样本鲜重（g/mL）
注：标准品的稀释倍数要根据样品中 NAD 和 NADH 浓度确定，样品中 NAD 和 NADH 的峰面积必须落在不同浓度的 NAD 和 NADH 标准品的峰面积之内，该标准曲线紧供参考。
