ELISA检测中阴性本底形成的原因及处理方法
ELISA试验中，经常会碰到阴性本底的问题。主要是本底过高和不同标本的本底值差异较大，本底在ELISA中的非特异性显色。底物未经过酶作用而呈现的颜色称为空白。底物液如配置不当会出现一定的空白值。这个值只要不太高（A<0.05),可以从各测定值减除，并不影响实验结果。这里讨论的是不含代测抗原或抗体的阴性标本在ELISA中出现本底。
固相载体的吸附：
在酶免疫测定中，ELISA中的特点是利用固相载体作为分离游离和结合的酶结合物的手段。固相载体与吸附在其上的抗原或抗体形成固相抗原或固相抗体，即免疫吸附剂。通常所用的固相载体聚苯乙烯其表面主要是疏水基团，通过疏水键与蛋白质结合。这种吸附石物理性的非特异性吸附，虽然蛋白质的分子量，等电点,浓度等对吸附的量有一定的影响，蛋总的来说各种蛋白质均能吸附在聚苯乙烯载体的表面。因此除在包被时有目的地使抗原或抗体吸附在载体上外，在ELISA各个步骤中均有可能发生干扰物质的吸附，使zui终产生与受检抗原-抗体反应无关的显色，这是形成本底的主要原因。
阳性的显色和阴性的本底
夹心法试验中，阳性标本中含有检测系统中特异性的抗原或抗体，作为桥梁联结免疫吸附剂和酶结合物，使酶结合物吸附在固相上，无色底物在酶的作用下转变成有色产物，这就是阳性的显色，显色的深度与阳性标本中代测抗体或抗原的量成正比。阴性标本中不含代测的抗原或抗体，酶结合物不能联结在固相上，固不显色。酶结合物在固相上的非特异吸附通常有以下几条途径1·酶结合物与固相上包被蛋白质成分起反应。包被抗原不纯时，杂质蛋白也会吸附在固相载体上，某些杂质可与酶标抗体因 错认 而结合。2·酶结合物直接吸附在固相载体上。酶结合物是蛋白质，可以直接吸附在固相载体表面，试验中选择了不利于这种媳妇的条件，一般只要酶结合物工作浓度适当，反应一段时间后，经过*洗涤，可以避免这种吸附。3·在ELISA中引入*-亲和素系统，可以提高检测的灵敏度，但如果使用不当，可使本地加深，反而得不偿失。*表及蛋白质如比例不合适，极易形成较高的阴性本底。4·双抗体夹心法中标本中含有类风湿因子，也可能使阴性血清显色。类风湿因子是作用于多种动物IgG Fe段的自身抗体，多位IgM类，之一种多价抗体。在夹心法检测中充当抗原成分，同时与固相抗体及酶标抗体反应，是酶标抗体结合到载体上。
降低阴性本底主要有以下几个方面:
1·固相载体：在ELISA试验中有时碰到空白孔吸光值过高或高或赴孔实验结果差异很大，其原因可能与酶标板质量有关
2·包被抗原：包被抗原应先经纯化。从人血或组织中提取的抗原成分如HB-sAg，要*除去Ig杂质是很困难，用基本因工程从组抗原可以避免这种干扰。
3·酶标抗体：应采用价的酶标抗体，工作浓度高，稀释度大就可以减少吸附。
4·缓冲液：配制试剂的蒸馏水的质量十分重要，以新鲜重蒸
其他常见问题：
一、ELISA试验中结果显色淡、灵敏度品低的原因。
1、移液的样品吸量不足，移液时抽吸、排放太快，移液嘴内壁挂液太多货内壁不清洁，造成加样量不准。
2、恒温箱温度不是37℃（或43℃），或多块反应板重叠放置造成板孔内的实际温度偏差，使抗原、抗体复合物形成过少。
3、保温时间不足，抗原、抗体反应不*
4、显色剂加入量不足。
5、显色液的A、B液比例不对。、
6、洗涤时冲击力过大，洗涤液浸泡时间太长，洗涤次数增加，导致已形成的抗原、抗体复合物洗脱。
7、底物反应的温度不够，时间不足。
8、试剂盒在运输、保存期间放置的温度太高、时间过长，造成抗原、抗体效价下降，酶的活力降低。
9、试剂盒已超出保存有效期，抗原、抗体效价下降，酶活力降低。
二、ELISA试验中结果出现白板、阳性对照不显色的原因
1、洗涤液配制有误。
2、终止液误作为浓缩洗涤液或酶结合物稀释液使用。
3、漏加酶结合物，物价酶结合物或在酶标二抗的试验中实验顺序错误。
4、终止液当做底物缓冲液使用
5、配制溶液中残留了解灭火酶活力的物质。
6、底物中未加OPD或TMB。
7、运输、贮存不当，导致没活力丧失。
8、底物液中未加过氧化氢或放置过久过氧化氢失效。
三、而莉萨是严重结果全部显色的原因
1、酶结合物的浓度过大
2、恒温箱温度较高，酶结合物光片时间或底物显色时间过长。
3、洗涤不充分，样品中有其他成分残留或酶结合物残留。
4、底物配置时间过久，底物受光照射时间较长或被污染。
5、整批样品放置时间过长被污染或生长细菌。
6、一夜醉从复使用时，未清洗干净或消毒不*
7、配制溶液的水质有问题。
四、ELISA试验中结果阴、样对照显色差距较小的原因
1、稀释不准。加样量不准。
2、加样时个*被污染
3、底物不新鲜，配制时间较长或被污染。
4、试剂效价下降或超过了试剂的有效使用期。
5、配制溶液的水质有问题
五、ELISA试验中结果重复性不好的原因
1、样品加入量多少不一，加样时间又长又短。
2、样品加入后为充分混合均匀。
3、移液加样器加样量不一致。
4、酶标仪滤光片不对。
5、操作过程中个别反应孔中液体外溅。
6、不同批号试剂混用。
7、瓶盖交叉使用
8、温育条件和保温时间不一致。
9、洗涤条件不一致。
10、显色条件和时间不一致。
11、边缘效应，导致周边孔（尤为4个较）较*孔显色为深。
12、将酶结合物或底物溶液加载了孔壁上，并有残留。
13、酶结合物充分混匀就加入反应孔中。
14、多加或少加了酶结合物、底物。
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