组织NADPH氧化酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
组织NADPH氧化酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在使用特异性抑制剂，通过反应系统测定样品中还原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化后峰值的降低，即采用光度法测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种组织样品（动物或人体）还原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH氧化酶）的特异活性检测。用于免疫、血液研究、蛋白组学、病理生理学等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。
技术背景
NADPH氧化酶，通常称为还原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase；NADPH oxidase；EC1.6.3.1）或还原型辅酶II氧化酶，是机体防御机制中的重要元素。NADPH氧化酶由6个亚体构成：Rho GTP酶（Rho guanosine triphosphatase）和5个phox（吞噬细胞氧化酶；phagocytic oxidase）。其中主要包含细胞膜嵌合蛋白质分子（gp91phox、p22phox、flavocytochrome b558等），以及位在细胞质内的蛋白质分子（p47phox、p67phox、p40phox、Rac1、Rac2等）。其zui特征性的酶活性是超氧化物歧化酶敏感的还原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶。细胞膜上的NADPH氧化酶被激活，将还原型辅酶Ⅱ（NADPH）转变为氧化型辅酶Ⅱ（NADP），氧分子则获得电子形成超氧阴离子O2-，由O2-又可生成H2O2和OH－。其超氧阴离子产物具有杀死微生物的功能。NADPH氧化酶异常将导致慢性肉芽肿病（Chronic Granulomatous Disease；CGD）。基于底物还原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），在特异性抑制剂联苯基三价碘（diphenyleneiodonium；DPI）的存在下，受到NADPH氧化酶的催化作用，转化为氧化型*腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP），产生吸光峰值的变化，通过分光光度仪（340nm波长）检测，来测定NADPH氧化酶的特异活性。其反应方式为：
产品内容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
缓冲液（Reagent C） 毫升
反应液（Reagent D） 毫升
阴性液（Reagent E） 毫升
底物液（Reagent F） 微升
专性液（Reagent G） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存清理液（Reagent A）和阴性液（Reagent E）在4℃冰箱里，其余的保存在在－20℃冰箱里，避免反复冻融；反应液（Reagent D）和底物液（Reagent F），避免光照，有效保证6月
用户自备
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器
4℃（微型）台式离心机：用于样品处理
恒温培养箱或恒温水槽：用于反应物孵育
比色皿：用于光度测定的容器
分光光度仪：用于光度分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；反应液（Reagent D）和底物液（Reagent F）注意避光。然后进行下列操作。
一、样品准备
- 手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量
- （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
- （选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
- 移入到一个液氮冻存管
- 即刻放进液氮罐过夜
- 次日从液氮罐里取出，即刻（zui快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
- 放进一个15毫升锥形离心管
- 加入置于冰槽里的xx微升裂解液（Reagent B）
- 强力涡旋震荡30秒，充分混匀
- 放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）
- 即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
- 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
- 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
- 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用
二、测定准备
- 从-70℃取出待测样品（例如组织裂解悬液样品等），置于冰槽里
- 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔60秒，读数6次（共5分钟），并置零
- 缓冲液（Reagent C）室温预热
- 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升反应液（Reagent D）
- 加入xx微升底物液（Reagent F）
- 放进30℃培养箱里静置3分钟
- 加入xx微升阴性液（Reagent E）
- 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
- 即刻放入分光光度仪检测，此为背景空对照：（340波长读数）0分钟－（340读数）5分钟
- 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升反应液（Reagent D）
- 加入xx微升底物液（Reagent F）
- 放进30℃培养箱里静置3分钟
- 加入100微升待测样品（注意：50至100微克组织裂解悬液蛋白；样品须溶解；参见注意事项5、11和12）
- 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
- 即刻放入分光光度仪检测，此为样品总活性读数：（340波长读数）0分钟－（340读数）5分钟
- 准备1个1.5毫升离心管
- 加入xx微升专性液（Reagent G）
- 加入100微升待测样品（注意：50至100微克组织裂解悬液蛋白；样品须溶解；参见注意事项5、11和12）
- 放进30℃培养箱里静置5分钟
- 放进冰槽里备用
- 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升反应液（Reagent D）
- 加入xx微升底物液（Reagent F）
- 放进30℃培养箱里静置3分钟
- 加入上述冰槽里的xx微升含有专性液（Reagent G）和待测样品的溶液
- 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
- 即刻放入分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：（340波长读数）0分钟－（340读数）5分钟
六、计算样品活性
1）样品总活性和非特异活性
2）样品特异活性
注意事项
- 本产品为21次（10个样本）操作，包括1次背景对照测定
- 操作时，须戴手套
- 反应液（Reagent D）和底物液（Reagent F）注意避光
- 系统操作过程中，背景测定只需1次
- 样品检测前，须溶解和澄清
- 加样后3秒内进行光度测定
- 光度测定后，比色皿须清洗*
- 样品0秒读数通常和背景空对照0秒读数一致
- 反应测定值由高到低变化；测定持续5分钟
- 测定值由高到低变化，表明有酶活性
- 建议待测样本蛋白浓度为50至100微克/100微升；如果样本酶活性过低，则可以增加样本量（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）
- 如果使用纯化目标蛋白，则蛋白浓度为1至5微克/100微升；如果使用纯化膜蛋白，则蛋白浓度为10微克/100微升
- 样品实际活性是指联苯基三价碘（diphenyleneiodonium；DPI）敏感的还原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，去除其它干扰因素
- NADPH氧化酶活性单位浓度定义：在30℃室温下，pH 7.0的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）氧化1微摩尔的还原型辅酶Ⅱ（NADPH）
- 本公司提供系列氧化酶类分析技术产品
质量标准
使用承诺
秉着“信誉*、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。
友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。
