过氧化物酶(Peroxidase，POD)试剂盒说明书
分光光度法 50 管/48 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：
POD（EC 1.11.1.7）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。
测定原理：
POD 催化 H2O2 氧化特定底物，在 470nm 有特征光吸收。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水
试剂的组成：
提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体×2 瓶，4℃保存；用时每瓶加入 5mL 试剂一充分溶解；用不完的试剂 4℃保存；试剂三：液体 10 mL×1 瓶，4℃保存。
粗酶液提取：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤和加样表：
1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 470nm，蒸馏水调零。
2、 测定前将试剂一、二和三在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）放置 10min 以上。
3、 样本测定表
试剂名称（µL） | 测定管 |
样本 | 15 |
蒸馏水 | 270 |
试剂一 | 520 |
试剂二 | 130 |
试剂三 | 135 |
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- 1mL 玻璃比色皿中按顺序加入上述试剂，立即混匀并计时，记录 470nm 下 30s 时的吸光值 A1 和 1min30s 后的吸光值 A2。计算 ΔA＝A2-A1。
注意：
1、若一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三和蒸馏水按比例配成混合液，在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）放置 10min 以上，测定时加入 15µL 样本和 1055µL 混合液测定。
2、如果 ΔA 小于 0.005，可将反应时间延长到 5min。如果 ΔA 大于 0.5，可将样本用提取液稀释后测定，计算公式中乘以相应稀释倍数。
POD 活性计算：
1、血清（浆）POD 活性
单位定义：每 mL 血清（浆）在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 为一个酶活力单位。
计算公式：
POD（U/mL）=ΔA×V 反总÷V 样÷0.01÷T =7133×ΔA 2、组织、细菌或细胞 POD 活性
- 按样本蛋白浓度计算
单位定义：每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 为一个酶活力单位。POD（U/mg prot）＝ΔA×V 反总÷（V 样×Cpr）÷0.01÷T =7133×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每 g 组织在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 为一个酶活力单位。POD（U/g 鲜重）＝ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.01÷T =7133×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位定义：每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 为一个酶活力单位。
POD（U/104 cell）＝ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.01÷T =14.27×ΔA
- 反总：反应体系总体积，1.07mL； V 样：加入样本体积，0.015mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
