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血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。

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假如背景过高，而您怀疑洗涤不够时，可以尝试增加洗涤次数。这种封锁液便宜、不乱，在去除洗涤过程中的一些非特异结合上很有用。假如浓渡过高，或者未准确稀释，则会导致高背景。常用的蛋白封锁液包括牛血清白蛋白（BSA）、脱脂奶粉、正常血清和鱼明胶。封锁液的作用是让不相关的蛋白占据微孔板中潜伏的结合位点。ELISA实验的原理好像很简朴，不过乎固定抗原，添加一抗、二抗和底物，间中夹杂着洗涤和封锁。

假如您的背景过高，怀疑封锁不充分，那么您可以尝试使用更高浓度的封锁液，或适当延长封锁时间。血清组分的内在多样性可使它有效拦截很多不同类型的分子相互作用。另一个选择是使用蛋白和非离子型去污剂这两种封锁液，后者可协助洗涤过程中的封锁。解决这个题目的一种方法是使用鸡或鱼的正常血清。好的封锁液应降低非特异性结合，但它不应当与抗原、抗体或检测试剂发生相互作用。在实验结束时，我们是否能获得有意义的信息，这在很大程度上取决于结果的信噪比。

假如您的ELISA不幸地碰到了高背景，那么也无需太担心，依次查看ELISA系统中的组分，并排除可能存在的题目。记住，非特异的抗体结合会增加背景。不外，它的缺点在于能与Protein A和IgG抗体相互作用。为了防止这一点，切勿使用过多的一抗或二抗。请勿使用高浓度（正常浓度为0.01-0.1%），它会降低特异结合，产生假阴性。这就降低了可产生信号的抗体非特异结合的机会。目前主要有两种类型的封锁液：蛋白和非离子型去污剂。您当然也希望抗体只与目的蛋白结合吧。

假如背景您一直被背景题目所困扰，那么也许您该花些时间来优化封锁液。