丙酮酸脱羧酶（PDC）活性测定试剂盒

测定意义：

PDC主要存在于酵母中，是乙醇发酵的关键酶之一，催化丙酮酸脱羧生成乙醛。

测定原理：

PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛，添加乙醇脱氢酶（ADH）来进一步催化 NADH还原乙醛生成乙醇和NAD⁺；NADH在340 nm有吸收峰，而NAD⁺没有；通过测定340 nm光吸收下降速率，来计算PDC活性。

自备仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体×1瓶，4℃保存。

试剂四：液体×1瓶，﹣20℃保存。

混合试剂：临用前配制，小心把试剂四转移到试剂三中，充分溶解。

试剂六：液体×1管，4℃保存。

粗酶液提取：

称取约0.1g样品，加试剂一1 mL，冰上充分研磨，16000g 4℃离心20min，取上清液，待测。

PDC测定操作：

1. 分光光度计预热30min以上，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于25℃水浴中预热30min以上。

3. 空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸馏水、20μL混合试剂、140μL试剂二和20μL试剂六，迅速混匀后于340nm比色，记录15s和75s的吸光值，分别记为A1和A2。

4. 测定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、20μL混合试剂、140μL试剂二和20μL试剂六，迅速混匀后于340nm比色，记录15s和75s的吸光值，分别记为A3和A4。

PDC活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中，每毫克蛋白每分钟催化1μmol NADH 氧化为1U。

PDC (U/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷(ε×d)×V总×10⁶}÷(Cpr×V样) ÷T

=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

活性单位定义：25℃中，每克样品每分钟催化1μmol NADH 氧化为1U。

PDC (U/g 鲜重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷(ε×d)×V总×10⁶}÷(V样÷V样总×W) ÷T

=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V总：反应体系总体积，0.2mL=2×10^-4 L，V样：加入反应体系中上清液体积，0.02mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：蛋白浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量试剂盒；W ：样品质量； T：反应时间，1 min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中，每毫克蛋白每分钟催化1μmol NADH 氧化为1U。

PDC (U/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷(ε×d)×V总×10⁶}÷(Cpr×V样) ÷T

=3.22×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

活性单位定义：25℃中，每克样品每分钟催化1μmol NADH 氧化为1U。

PDC (U/g 鲜重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷(ε×d)×V总×10⁶}÷(V样÷V样总×W) ÷T

=3.22×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V总：反应体系总体积，0.2mL=2×10^-4 L，V样：加入反应体系中上清液体积，0.02mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：蛋白浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量试剂盒；W ：样品质量； T：反应时间，1 min。