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上海信帆科技有限公司:CAMKII激酶活性检测试剂盒说明书

时间:2015-5-26阅读:1472
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上海信帆生物科技有限公司代理销售“细胞CAMKII激酶活性光度法定量检测试剂盒",现货供应,欢迎。CAMKII激酶活性检测试剂盒说明书。


细胞CAMKII激酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)


主要用途


本所细胞CAMKII激酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物受到CAMKII磷酸化后,进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统,测定产生ADP过程中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH)的氧化反应,即采用光度法测定其氧化后吸光峰值的变化,以分析细胞裂解样品中CAMKII活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适用于各种细胞裂解萃取液样品(动物、人体)、部分或*纯化酶样品中CAMKII激酶的定量检测,以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,高度敏感。


技术背景


Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases;CAMK;EC2.7.11.17)属于丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine protein kinase)家属成员之一,主要由Ca2+/钙调素复合物调控,在细胞分裂和分化、神经传导介质分泌、转录因子调节、糖原代谢、肌肉收缩、记忆、心功能等方面发挥作用。在大多数组织中表达,尤其在神经组织中高度表达。功能分类为特异型,其代表为肌凝蛋白轻链蛋白激酶(myosin light chain kinase;MLCK)和多功能型,其代表为Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶IICa2+/calmodulin-dependent protein kinases II;CAMKII)。亚型分类为I型、II型、和IV型。亚体分类为αβγδ四种。Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶有3个结构域:N端催化域(catalytic)、中央调节域(regulatory,包含自发抑制域——autoinhibitory domain;AID和Ca2+/钙调素结合中心),和C端协同域(association),Ca2+/钙调素复合物激活CAMK后,产生自发性自我磷酸化。Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶II主要作用于中枢神经系统,调节细胞内钙离子瞬时变化,诱导长时程增强(potentiation)、突触可塑性(synaptic plasticity)、神经传导介质合成和释放、与记忆和学习功能相关。其磷酸化目标序列为KKALRRQETVDAL基于底物KKALRRQETVDAL,在ATP的存在下,受到Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶II的磷酸化,获得产物磷酸化多肽,进而通过丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase;LDH)反应系统中,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotideNADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotideNAD),其吸光峰值的变化340nm,来定量分析Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶II的活性其反应方式为:


产品内容


本所清理液(Reagent A)   毫升

本所裂解液(Reagent B)   毫升

本所缓冲液(Reagent C)  毫升

本所酶促液(Reagent D)  微升

本所反应液(Reagent E)  微升

本所底物液(Reagent F)   微升

本所阴性液(Reagent G)  微升

产品说明书     1份


保存方式


保存本所清理液(Reagent A)4冰箱里;其余的保存在-20冰箱里,严格避免光照和反复冻融;有效保证6


用户自备


CAMKII激酶:用于抑制剂筛选

1.5毫升离心管:用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管:用于样品处理的容器

细胞刮脱棒:用于贴壁细胞脱离

(微型)台式离心机:用于样品预处理

100微升1厘米光径比色皿或96孔板:用于光度分析操作的容器

分光光度仪或酶标仪:用于样品光度分析


实验步骤


  • 待测样品准备


  • 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞(15 X 107细胞)
  • 小心加入xx毫升本所清理液(Reagent A,覆盖生长表面
  • 小心抽去清理液
  • 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:避免使用胰酶消化
  • 加入xx毫升本所清理液(Reagent A,混匀细胞
  • 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始
  • 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微升本所裂解液(Reagent B,充分混匀
  • 转移到预冷的1.5毫升离心管
  • 强力涡旋震荡15
  • 置于冰槽里孵育30分钟
  • 放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415
  • 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
  • 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用本所 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-GMS30030.1
  • 即刻放进-70保存或置于冰槽里继续后续操作
  • 测定准备


  • 准备好待测样品(例如细胞裂解悬液等),置于冰槽里 
  • 设定好分光光度仪(温度为30℃):波长为340nm,间隔1分钟,读数6次(共5分钟),并置零
  • 本所缓冲液(Reagent C室温下均衡温度


  • 背景对照测定


  • 移取xx微升本所缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升本所阴性液(Reagent G
  • 放进30培养箱里静置10分钟
  • 加入xx微升本所酶促液(Reagent D
  • 加入xx微升本所反应液(Reagent E
  • 加入xx微升本所底物液(Reagent F
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340波长读数0分钟 340波长读数5分钟


  • 样品测定


  • 移取xx微升本所缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入5微升待测样品(注意:50微克细胞裂解蛋白;样品须溶解
  • 放进30培养箱里静置10分钟
  • 加入xx微升本所酶促液(Reagent D
  • 加入xx微升本所反应液(Reagent E
  • 加入xx微升本所底物液(Reagent F
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性读数:340波长读数0分钟 340波长读数5分钟


  • 计算样品活性



  • 酶标仪测定


  • 96孔板上做好相应标记:背景对照和样品
  • 分别移取xx微升本所缓冲液(Reagent C到96孔板
  • 分别加入xx微升本所阴性液(Reagent G待测样品(50微克细胞裂解悬液蛋白)到相应孔(注意:样品须清澈
  • 30℃温度下孵育10分钟
  • 分别加入xx微升本所酶促液(Reagent D
  • 分别加入xx微升本所反应液(Reagent E
  • 分别加入xx微升本所底物液(Reagent F
  • 轻轻摇动96孔板
  • 即刻放进酶标仪检测:0分钟读数和5分钟读数
  • 活性计算:



七、抑制剂筛选


  • 96孔板上做好相应标记:背景、*活性和待测抑制剂样品
  • 按下表加入试剂,进行样品预处理


内容物

空背景对照

样本背景

*酶活性

待测抑制剂酶活性

本所缓冲液(Reagent C

xx微升

xx微升

xx微升

xx微升

本所阴性液(Reagent G)

xx微升

xx微升

xx微升

——

待测抑制剂

——

xx微升

――

xx微升

用户自备的纯化酶

——

——

xx微升(1毫单位)

xx微升(1毫单位)

96孔板每孔总量

空背景对照

xx微升)

样本背景孔

xx微升)

*活性

xx微升)

待测抑制剂样品

xx微升)

轻轻摇动96孔板,混匀放进30培养箱里孵育15分钟


  • 分别加入xx微升本所酶促液(Reagent D
  • 分别加入xx微升本所反应液(Reagent E
  • 分别加入xx微升本所底物液(Reagent F 
  • 轻轻摇动96孔板
  • 即刻放进30酶标仪检测:测读30分钟
  • 抑制活性计算:


注意事项


  • 本产品为25次操作,包括背景操作
  • 操作时,须戴手套
  • 系统操作过程中,背景测定只需1
  • 样品处理忌用磷酸缓冲溶液 
  • 样品须澄清,至关重要 
  • 启动反应后3秒内即刻光度测定
  • 测定值由高到低变化;测定可持续30分钟
  • 光度测定后,比色皿须清洗*
  • 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
  • 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升(本公司提供 本所 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-GMS30030.1) 
  • 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
  • 可以使用CAMKII抑制剂(KN-93;IC50=370纳摩尔)作为抑制剂对照或阴性对照
  • Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶II活性单位浓度定义:在30温度下,pH 7.5条件下,每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH所需的酶量作为一个活性单位
  • 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品


质量标准


  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测敏感


使用承诺


公司秉着信誉、客户满意、质量承诺"的宗旨为我们的用户提供产品和服务。用户收到货后,应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定,保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题,请立即以书面形式(实验报告)与本公司,并将该产品退回,经检验确系产品质量所致,本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致,本公司不承担由此造成的损失。



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