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微量分型巯基测试盒

（酶标微板法）

一、试剂的组成与配制：（24T）

试剂一：标准品粉剂，3 支，4℃密封保存 6 个月。

10mmol/L 标准品贮备液的配制：每次测定前将 1 支标准品

粉剂加 1mL 试剂三-缓冲液溶解，即为 10mmol/L

标准品贮备液，4℃密封保存。

500μmol/L 的标准应用液的配制：10mmol/L 标准品∶试剂

三缓冲液=1∶19 即 20 倍稀释配成应用液，按所

需量现用现配。

试剂二：透明剂，2mL×1 瓶，4℃密封保存 12 个月（天冷

时会凝固，每次测试前适当水浴加温以加速溶解，

直至透明方可应用）。

试剂三：缓冲液，20mL×1 瓶，4℃密封保存 6 个月。

试剂四：显色剂，3mL×1 瓶，4℃避光保存 6 个月。

工作液一的配制：按透明剂∶缓冲液∶显色剂=1∶50∶25

的比例混合，用多少配多少。

工作液二的配制：按透明剂∶缓冲液=1∶75 的比例混合，用

多少配多少。

注：按所需检测的样本数加上标准孔及标准空白孔的数，

再放宽 2 孔进行工作液的配制（避免吸到最后试剂

量不够）。工作液需现用现配，最多可保存 1～2 天。

试剂五：沉淀剂，10mL×1 瓶，室温保存 6 个月（过饱和溶

液，如有结晶析出，直接取上清使用）。

96 孔板：一块（本公司赠送）。

二、操作步骤：

1、血清（浆）样本前处理：

①、总巯基：

直接取样进行测定。

②、非蛋白巯基：

待测样本：取血清（浆）50μL,加入 150μL 试剂五

沉淀剂（也可按照样本：试剂五=1：3

比例上下调整），充分混匀 3500-4000

转/分离心 10 分钟，取上清 10μL 待测；

待测标准：取 500μmol/L 的标准应用液 50μL，加

入 150μL 试剂五沉淀剂，充分混匀后取

10μL 待测（此时标准应用液浓度为

125μmol/L）

2、动、植物组织、培养细胞前处理：

动物组织：准确称取待测动物组织的重量，按重量体

积比（动物组织︰生理盐水＝1g︰9mL），将动物

组织剪碎后加生理盐水用匀浆机或匀浆管制备成

10%的动物组织匀浆，2500～3000 转/分，离心 10

分钟取上清（即 10%组织匀浆）待测。

植物组织：准确称取待测植物组织的重量，按重量体

积比（植物组织︰0．1mol /L pH7～7.4 磷酸盐缓

冲液＝1g︰9mL），将植物组织剪碎后加 0.1mol/L

pH 7～7.4 磷酸盐缓冲液用匀浆机或匀浆管制备成

10%的植物组织匀浆，3500～4000 转/分，离心 10

分钟取上清（即 10%组织匀浆）待测。

培养细胞：将细胞进行胰-酶消化（也可将细胞直接刮

下），取出细胞及液体放入试管，1000 转/分～3000

转/分，离心 5 分钟，弃上清，留沉淀细胞，再加

入 1mL 生理盐水轻轻吹打混匀（将胰-酶及部分培

养液洗去），1000 转/分～3000 转/分，离心 5 分钟，

弃上清，留沉淀细胞加入 0.2～0.3mL 的生理盐水

进行匀浆（匀浆的方法有多种：例如①

加细胞裂

解液裂解细胞；② 在冰水浴下超声粉碎细胞；③

手动匀浆管进行匀浆；④ 在冰水浴下用卡富隆电

动玻璃匀浆器电动研磨，每次 5～10 秒，间隔 20

秒，总共研磨 3～4 次），取匀浆液待测。

①、总巯基：直接取样进行测定。

②、非蛋白巯基：

待测样本：取匀浆 50μL,加入 150μL 试剂五沉淀剂

（也可按照样本：试剂五=1：3 比例上

下调整），充分混匀，3500-4000 转/分

离心 10 分钟，取上清 10μL 待测；

待测标准：取 500μmol/L 的标准应用液 50μL，加

入 150μL 试剂五沉淀剂，充分混匀后取

10μL 待测（此时标准应用液浓度为

125μmol/L）。

四、测定原理：

5，5’-二硫代双，2-硝基苯甲酸（DTNB）与巯基化合

物反应时能产生一种黄色化合物，可进行比色定量测定。

五、所需仪器：

单道移液器：可进行单孔的加样工作

多道移液器：可进行 8 或 12 孔的加样工作

酶标仪，用于微量样品比色分析，吸光度值测定

96 孔酶标板：用于比色的孔板（本所赠送）

六、检测意义：

活性巯基（SH）主要存在于半胱-氨-酸，是蛋白质结构

和生物体内某些氧化还原反应重要基团。在蛋白质结构中

2 个巯基脱氢而形成的双硫键，使相邻多肽得以连接．对

于维持蛋白质完整结构十分重要。所有动物组织都含有不

同量的活性巯基，机体内起重要作用的谷-胱-甘-肽，其生理

作用主要是靠所含半胱-氨-酸中活性巯基起还原作用。巯基

还是很多酶活性基团，一些重金属盐如 Hg 2+等与酶巯基结

合，影响酶活性。巯基化合物与机体许多机能活动，药物

及毒物的作用以及某些疾病的发生发展有着密切关系。测

定组织和血液中巯基含量已日益为人们所重视,以期探索

对某些疾病的发生机理、治疗、预防以及预后判断等方面

的研究意义。

七、标准曲线的制备：

取一定量的 10mmol/L 标准品贮备液用试剂三 缓冲液

配 制 成 不 同 浓 度 的 标 准 制 作 标 准 曲 线 ： 0mmol/L 、

100μmol/L 、 200μmol/L 、 500μmol/L 、 1000μmol/L 、

2000μmol/L。

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