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硫氧还蛋白过氧化物酶测定试剂盒

（Thioredoxin peroxidase，分光光度法 100T/48 样）

一、测定意义

TPX属于过氧化物酶家族，在体内主要通过还原过氧化氢和一些氢过氧化物来实现抗氧化作用，功能与GPX类似，也是谷-胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。TPX普遍存在于各种生物体内，如酵母、植物、动物、原生动物、寄生虫、细菌和古细菌，在进化上高度保守。TPX与细胞增殖、分化、细胞凋亡及肿瘤发生调控密切相关。TPX的主要功能包括细胞脱毒、抗氧化和调节由过氧化氢介导的信号转导和免疫反应。

二、测定原理

TPX催化H2O2氧化二硫苏糖醇（DTT），H2O2的吸收波长为240nm，通过测定240nm吸光度的下降速率，通过对照减去过氧化氢酶（CAT）催化分解的H2O2，即可计算出TPX活性。

因此，本试剂盒可以同时测定样品TPX和CAT活性。

三、自备仪器用品

低温离心机、紫外分光光度计、水浴锅、1mL石英比色皿、可调节移液枪、蒸馏水

四、试剂组成和配制

试剂一 液体×1 瓶，室温保存；

试剂二 液体×1 瓶，-20°C保存；

试剂三 液体×1 支，4°C保存。

五、粗酶液提取

1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)1：5~10 的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。10000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2.细菌、真菌： 按照细胞数量（10 4个）：试剂一体积(mL)500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎（功率300W，超声3s，间隔7秒，总时间3min）；在4°C下1000g离心10min，取上清，置冰上待测。

六、TPX测定步骤

1. 分光光度计预热30min 以上，调节波长到240nm，用蒸馏水调零；

2. 试剂一和试剂二置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热30min 以上；

3. CAT活性测定管：取1mL石英比色皿，加入20μL上清液，900μL试剂一，80μL试剂三，迅速混匀后与240nm测定10s和130s吸光度，分别为A1和A2，计算ΔACAT=A1-A2

4. 总活性测定管：取1mL石英比色皿，加入20μL上清液，900μL试剂二，80μL试剂三，迅速混匀后与240nm测定10s和130s吸光度，分别为A3和A4。ΔA总=A3-A4

注：对大量样品，每个样品都需要单独测定其CAT活性。

七、TPX活性计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

活性单位定义：在37℃或25℃，每毫克蛋白每分钟催化1μmol H2O2为1U。

CAT活性(U/mg prot) = △ACAT÷(ε×d)×V反总÷(Cpr×V样)÷T =0.573×△ACAT÷ Cpr

总活性（U/mg prot）=△A总÷(ε×d)×V反总÷(Cpr×V样)÷T =0.573×△A总÷ Cpr

TPX活性（U/mg prot）=总活性-CAT活性

(2) 按样本质量计算

单位的定义：在37℃或25℃，每g组织每分钟催化1μmol H2O2为1U。

CAT活性（U/g） △ACAT÷(ε×d)×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T =0.573×△ACAT÷W

总活性（U/g）=△A总÷(ε×d)×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T =0.573×△A总÷W

TPX活性（U/g）=总活性-CAT活性

(3) 按细胞数量计算

单位的定义：在37℃或25℃，每10 4个细胞每分钟催化1μmol H2O2为1U。

CAT活性（U/10 4 cells） = △ACAT÷(ε×d)×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T =0.573×△ACAT÷细胞数量

总活性（U/10 4 cells）=△A总÷(ε×d)×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T =0.573×△A总÷细胞数量

TPX活性（U/10 4 cells）=总活性-CAT活性

ε：H2O2在240nm 处摩尔吸光系数为4.36×10 4L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm；

d：比色皿光径（cm），1cm；

V反总：反应体系总体（L），1000μL=1×10 -3L；

Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA 蛋白质含量测定试剂盒；

V样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02mL；

V样总：加入提取液体积，1mL；

T：催化反应时间（min），2min；

W：样本质量，（g）；

细胞数量，（10 4）。

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