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己糖激酶(HK)试剂盒

(分光光度法 50 管/48 样)

一、测定意义：

己糖激酶(Hexokinase, HK )(EC 2.7.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是葡萄糖分解过程中的第一个关键酶，催化葡萄糖转为 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。

二、测定原理：

HK 催化葡萄糖合成 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化 6-磷酸葡萄糖脱氢生成

NADPH,NADPH 在 340nm 有特征吸收峰。

三、自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰、蒸馏水。

四、试剂的组成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；×

试剂一：液体 30mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 30mL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂三：液体 5mL×1 瓶，4 度保存；

试剂四：粉剂×1 支，-20℃保存，临用前加入 4mL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂五：粉剂×1 支，-20℃保存，临用前加入 2mL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存，临用前加入 250μL 试剂一和 250μL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

五、样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10 4）：提取液体积（mL）为 500-1000:1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20%或 200W，超声 3S,间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1:5-10 的比例（建议称取 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

六、测定步骤：

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预实验

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、将试剂一、二、三、四和五 37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）预热 10 分钟。

注意事项：

1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三、四、五和六按照比例配成混合液，预热 10min。

2、不同匀浆组织中的 HK 活力不一样，做正式实验之前请做 1-2 只预试，若△A>0.5，则说明组织活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液（计算公式中乘以相应稀释倍数），或缩短反应时间至 2min，使△A<0.5，以提高检测灵敏度。

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