本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相 关液体样本中高迁移率族蛋白 B1(HMGB1)含量。
实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠高迁移率族蛋白 B1(HMGB1)水平。用纯化的小 鼠高迁移率族蛋白 B1(HMGB1)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加 入高迁移率族蛋白 B1(HMGB1)，再与 HRP 标记的羊抗鼠抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体 复合物，经过*洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸 的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠高迁移率族蛋白 B1(HMGB1)呈正相 关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中小鼠高迁移 率族蛋白 B1(HMGB1)浓度。
试剂盒组成：
试剂盒组成 | 48 孔配置 | 96 孔配置 | 保存 |
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说明书 | 1 份 | 1 份 | |
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封板膜 | 2 片（48） | 2 片（96） | |
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密封袋 | 1 个 | 1 个 | |
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酶标包被板 | 1×48 | 1×96 | 2-8℃保存 |
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标准品：18μg/L | 0.5ml×1 瓶 | 0.5ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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标准品稀释液 | 1.5ml×1 瓶 | 1.5ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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酶标试剂 | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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样品稀释液 | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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显色剂 A 液 | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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显色剂 B 液 | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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终止液 | 3ml×1 瓶 | 6ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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浓缩洗涤液 | （20ml×20 倍）×1 瓶 | （20ml×30 倍）×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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样本处理及要求：
- 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
- 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次 离心。
- 尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
- 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/ 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞 浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分
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钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
- 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备 用。标本融化后仍然保持 2-8℃的温度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或匀浆器 将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。分装后一份待 检测，其余冷冻备用。
- 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上 进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
- 不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
- 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔 10 孔，在*、第二孔中分别加标 准品 100μl，然后在*、第二孔中加标准品稀释液 50μl，混匀；然后从*孔、第二 孔中各取 100μl 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液 50μl， 混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 弃掉，再各取 50μl 分别加到第五、第六孔 中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各 取 50μl 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50μl，混 匀后从第七、第八孔中分别取 50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准 品稀释液 50μl，混匀后从第九第十孔中各取 50μl 弃掉。（稀释后各孔加样量都为 50μl，
浓度分别为 12μg/L，8μg/L ，4μg/L，2μg/L， 1μg/L）。
- 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μl，然后再加待测样品 10μl（样 品zui终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混 匀。
- 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。
- 配液：将 30（48T 的 20 倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30（48T 的 20 倍）倍稀释后备用。
- 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此 重复 5 次，拍干。
- 加酶：每孔加入酶标试剂 50μl，空白孔除外。
- 温育：操作同 3。
- 洗涤：操作同 5。
- 显色：每孔先加入显色剂 A50μl，再加入显色剂 B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
15 分钟.
- 终止：每孔加终止液 50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
- 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止 液后 15 分钟以内进行。
注意事项：
1． 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未 用完，板条应装入密封袋中保存。
2． 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3． 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间 控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4． 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值 大于标准品孔*孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计 算时请zui后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
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6． 底物请避光保存。
7． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8． 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9． 本试剂不同批号组分不得混用。
10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
计算：
以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，
在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释 倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值 代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释 倍数，即为样品的实际浓度。
（此图仅供参考）
试剂盒性能：
1.样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.92 以上。
2.批内与批间应分别小于 9%和 15%
检测范围：
0.75μg/L -15μg/L
保存条件及有效期：
1.试剂盒保存：2-8℃。
2．有效期：6 个月
