请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至1ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为5,000 ng/ml，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比释），分别配制成5,000 ng/ml，2,500 ng/ml，1,250 ng/ml，625 ng/ml，312 ng/ml，156 ng/ml，78 ng/ml，样品稀释液直接作为空白孔 0 ng/ml。如配制2,500 ng/ml标准品：取0.5ml （不要0.5ml ）5,000 ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

3、 样品稀释液：1×20ml。

4、 检测稀释液A：1×10ml。

5、 检测稀释液B：1×10ml。

6、检测溶液A：1×120 /瓶（1:100）。临用前以检测稀释液A1:100稀释（如：10 检测溶液A /990 检测稀释液A），充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100 /孔），实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。

7、检测溶液B：1×120 /瓶（1:100）。临用前以检测稀释液B1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。

8、 底物溶液：1×10ml/瓶。

9、 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

10、终止液：1×10ml/瓶（2 mol/LH2SO4）。

11、覆膜：5张

12、使用说明书：1份

自备物品

1、酶标仪（建议仪器使用前提前预热）

2、微量加液器及吸头，EP管

3、蒸馏水或去离子水，滤纸标本的采集及保存

1、血清：全血标本请于室温放置2小时或4 过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20 或-80 保存，但应避免反复冻融。

2、血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于1000 g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20 或-80 保存，但应避免反复冻融。

3、其它生物标本：请1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20 或-80 保 存，但应避免反复冻融。

4、样本处理：血清或血浆标本*稀释200倍。标本使用0.02 M 的PBS稀释（PH=7.0-7.2）。

注：以上标本均应密封保存，4保存应小于1周，-20不应超过1个月，-80不应超过2个月;标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

操作步骤

实验开始前，各试剂均应平衡至室温，试剂不能直接在37 溶解;试剂或样品配制时，均需充分混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100 ，余孔分别加标准品或待测样品100 ，注意不要有气泡，加样 时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37 温育2小时。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2、弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100 （临用前配制），酶标板加上覆膜，37 温育1小时。

3、弃去孔内液体，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分钟，大约400 /每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4、每孔加检测溶液B工作液（临用前配制）100 ，加上覆膜，37 温育1小时。

5、弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。

6、每孔加底物溶液90 ，酶标板加上覆膜37 避光显色（反应时间控制在15-30分钟，当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。

7、每孔加终止溶液50 ，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。

8、立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（值）。

注：

1、 试剂准备：所有试剂在使用前应平衡至室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。

2、 加样：加样或加试剂时，*个孔与zui后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预温育"时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间（包括标准品及所有样品）控制在10分钟内。*设置复孔进行实验。

3、 温育：为防止样品蒸发，实验时将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发;洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态;同时应严格遵守给定的温育时间和温度。

4、 洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响zui后的酶标仪读数。

5、试剂配制：Detection A及DetectionB在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配制使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请配制标准品及工作液，尽量不要微量配制（如吸取检测溶液A时，一次不要小于10 ），以避免由于不准确稀 释而造成浓度误差;请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液。

6、 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔10分钟），如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。

7、 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。