上海通蔚生物科技有限公司

质体的转形和质体重组的检测

时间:2016-5-3阅读:199
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由于此质体为multiple copies,一般大肠杆菌菌株中lac repressor的含足以有效地进调控,纵使未加入inducer,也会有外源蛋白质的表现,万一外源蛋白质对寄主造成毒害,使的无法生长,我们可能表现质体无法选殖到,无法达成我们的实验目的。 我们所选用的寄主菌株JM109 所具有的 lacIq,能够过表现 (overproduce) lac repressor,因此可较有效地控制T5 promoter的启动。 然而,是JM109 这一类带有lacIq的菌株发生问题时,就必须再换其它的寄主菌株;如M15[pREP4],此菌株除染色体上的lacI基因外,还带有能持续表现lacrepressor的质体,应可解决lac repressor 足的问题。
检定载体上是否接上外的DNA 段,常因质体同而有同方法,一般常用外DNA 片段的插入导致载体某表现形的丧失 (insertional inactivation) 作为筛选的依据;或者可用插入的DNA 上带有宿主所缺少的表现型进筛选。载体与插入DNA 皆无适当的筛选依据,则可将菌中的质体抽出后,以限制酶作用后进电泳分析。而我们实验中所用的质体pQE31,并没有简快速筛选重组质体的方法可用,因此需要用GUS 的抗体进colony hybridization,寻找可表现出GUS的转形株;或在培养基中加入GUS 的基质,转形株可表现出GUS,则可将基质分解使菌呈现蓝色;或以质体快速抽取法,筛选带有正确分子质体的转形株。 三种方法请练习,得到的正反应株均必须再抽取质体进限制酶分析,以进一步确认质体的正确性。

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