免疫荧光法

１．直接法

（1）冰冻切片、涂片、印片或单层 细胞培养 物按要求进行固定，石蜡切片常规脱蜡后用酶消化处理，然后水化，用0.01mol/L PH7.2---7.4PBS洗5分钟，冷风吹干，放入湿盒中。

（2）滴加经稀释的荧光抗体，37℃ 30-60分钟或4℃ 过夜（3）PBS 洗2次，蒸馏水洗1次

（4）50%甘油缓冲液封片

（5）荧光显微镜下检查

（6）对照染色

①阳性对照，用已经证实的含有靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阳性。②阴性对照，用确知不存在靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阴性。③空白对照，用免去特异性抗体或用PBS替代特异性抗体，结果应为阴性。④抑制试验，将标记抗体(例荧光抗体)和未标记的抗体或血清等量混合后，按上述步骤处理切片，结果应为阴性（一步法）。或将待检切片两张，一张加未标记特异性血清，另一张加未标记同种正常血清，孵育后冲洗，再加入标记的特异性血清（例如特异性荧光标记抗体），加了未标记特异性血清的切片因抗原抗休已结合，故染色被抑制，呈阴性结果，而加同种正常血清的切片则呈阳性反应（二步法）。

对照染色非常重要，开始试验时应做全面对照，每次试验时应做阳性和阴性对照。

2．间接法

（1）标本处理同直接法。

（2）滴加适当稀释的特异性抗体于标本上，置湿盒中，３７℃ ３０～６０分钟或４℃过夜。

（3）滴加适当稀释的间接荧光抗体，置湿盒中，３７℃ ３０～６０分钟。

（５）ＰＢＳ洗２次，双蒸水洗１次。

（６）甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察。

（７）对照染色：可用空白对照和阴性对照等。