通过药物抗性的水平传播分析
实验材料 病毒细胞
试剂、试剂盒 polybrene小牛血清DMEM
仪器、耗材 培养皿滤膜
实验步骤
1. 在开始分析的前1天，按1：50将NIH 3T3细胞分传于3个6 cm 培养皿中。将1个培养皿标记为阳性对照，1个为阴性对照，1个用于待测病毒原液。
2. 含有选择标记的待测病毒的制备：加0.01 ml 800 μg/ml polybrene至1 ml 待测病毒上清中，通过0.45 μm 滤器过滤。
3. 含有选择标记的阳对照的制备：制备1 ml 无辅助病毒的病毒原液与10~100 CFU辅助病毒原液的混合液。加0.01 ml 800 μg/ml polybrene，通过0.45 μm 滤器过滤除菌。
4. 阴性对照病毒原液的制备：制备1 ml 无辅助病毒的病毒原液，加0.01 ml 800 μg/ml polybrene，通过0.45 μm滤器过滤除菌。
5. 用各病毒原液感染培养皿上的细胞。将感染后的3个培养皿置于37℃ CO2培养箱中温育1~3 h以利于吸收，加4 ml DMEM-10培养至细胞汇片。
6. 将细胞按1：50分传于新的6 cm 培养皿中。3个培养皿中每个仅传一个培养皿，弃去原来感染的细胞的无用的部分。使polybrene的终浓度在2 μg/ml 培养至细胞长到50%~90%汇片。
7. 弃去培养液换以半量的新鲜DMEM-10。再培养2~3天。
8. 收获生长汇片的细胞的zui终的上清。经0.45 μm 滤膜过滤，加polybrene至终浓度8 μg/ml。保存于-70℃~ -80℃，或立即用于滴定及分析标记抗性。
9. 在上清滴定前1夭，将新鲜的未经感染的NIH 3T3细胞按1：10或1：20分传于3个6 cm 培养皿中。用各种上清1 ml 感染口NIH 3T3细胞，并进行滴定的各步操作。如果出现了几千个neo抗性的克隆就说明原始的待测病毒原液中污染了辅助病毒。
反转录酶分析法
实验材料 病毒
试剂、试剂盒 SSC乙醇
仪器、耗材 滴定板滤纸离心机
实验步骤
1. 加50 μl RT反应混合物于96-孔微量滴定板的各孔中。每个待测或对照样品占一孔。加10 μl 病毒上淸，盖上平板，置于37℃培养箱中温育1~2 h。
2. 将各反应液10 μl 点于一张2.5 cm 直径的圆形DE52或DE81滤纸上，其上盖一张塑料薄膜用2号铅笔做标记。
3. 将滤纸置于一个盘中，加2XSSC覆盖。室温下在摇床上轻轻摇动冼涤20 min 弃去SSC重复洗涤步骤2次。在95%乙醇中浸泡1 min，空气中晾干约10 min。
4. 在闪烁计数仪中计数或用感光片曝光。
在Tris-Tricine缓冲系统中电泳
实验材料 蛋白质
试剂、试剂盒 Tricine样品缓冲液考马斯亮蓝染色液乙酸
仪器、耗材 电泳仪离心机
实验步骤
1. 按“Laemmli凝胶电泳法"的步骤1~7，配制溶液并灌制分离胶和积层胶。
2. 制备样品，但采用2×Tricine的样品缓冲液，加样前样品于40℃处理30?60 -11。多肽分子量标准混合物用作多肽分离的对照。
3. 组装电源装置并加样。但加样孔是以Tricine阴极缓冲液或水加以冲洗并以之充满；在电泳装置的下缓冲液槽加入阳极缓冲液，上缓冲液槽加入阴极缓冲液。
4. 连接电源，在30 V 恒压下电泳1 h 后，接着在150 V 恒压下电泳4 h。使用热交换装置使电泳缓冲液槽温度维持室温水平。
5. 当考马斯亮蓝G-250示踪染料到达凝胶的底部时，将电压调回零并断开电源。
6. 取出凝胶，在考马斯亮蓝G-250染色液中染色2 h，接着在10%乙酸水溶液中脱色，每隔30 min 换液1次，直至背景干净为止，需要更高检测敏感度时，推荐采用银染的方法。
