实验方法原理 限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体pUC18多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。
实验材料 DNA片段PUC18
试剂、试剂盒 R.Ebuffer水凝胶氯仿 异戊醇乙醇
仪器、耗材 离心机
实验步骤
1. 载体pUC18和外源DNA片段的限制性酶切：
50 μl反应体系，用1.5ml tube，冰上操作）
DNA 30 μl
R.E 1 μl
10×buffer 5 μl
ddH2O 14 μl
外源片段酶切产物和5 μl 37 ℃反应1hr，分别取8 μl PUC18酶切产物于1.0%凝胶检测酶切是否*；按2－5步纯化、回收DNA
2. 加入ddH2O 150 （扩大体积），加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000 g离心10 min；
3. 吸取上清，加1/10体积3 M NaAc和两倍体积无水乙醇，-20 ℃放置15分钟以上；
4. 12000 g 4 ℃冷冻离心15分钟；
5. ddH2O（1.5 ml ddH2O（0.5 ml tube中），PUC18溶于20 μl 倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，风干后外源DNA溶于10 tube中）；
6. 按以下反应去除载体PUC18的5’磷酸基团，50 ℃反应30 min 以上
DNA 20 μl
CIAP（TaKaRa） 0.5 μl
buffer 4.0 ′10 μl
ddH2O 15.5 μl
7. 70 ℃水浴10 min, 使CIAP失活；
8. 按2－5步纯化载体，溶于10 μl ddH2O；
9. 连接反应
DNA 10 μl
pUC18 2.5 μl
buffer 1.5 ′5 μl
mT4 ligase 3 U/μl
16 ℃水浴过
10. 转化大肠杆菌感受态细胞
11. 转化子的鉴定
