实验材料 核苷酸
试剂、试剂盒 SSC焦磷酸钠SDS
仪器、耗材 培养箱水浴锅
实验步骤
1. 制备双份的转印细菌菌落或噬斑的硝酸纤维素滤膜（处理和干烤过）。
2. 在室温下用3× SDS / 0.1%SDS溶液500 ml 洗膜3~5次。
3. 然后在65℃洗膜至少1.5 h 以上直至过。
4. 在预杂交液中37℃预杂交1 h。
5. 在装有20 ml 以上的SSC杂交液的可封口的杂交袋中可移入多达20张的滤膜。
6. 在毎 个杂交袋中每毫升杂交液加入0.125 ng 至1.0 ng 的每种32P标记的寡核苷酸。
7. 在以下给定的温度条件下寡核苷酸杂交14~48 h。
（1）14碱基——室温
（2）17碱基——37℃
（3）20碱基——42℃
（4）23碱基——48℃
8. 从杂交袋中取出滤胰，用6×SSC / 0.05%焦磷酸盐洗膜液在室温冼膜3~5次，每次 5~15 min。
9. 再用预热的洗膜液洗膜30 min。预热温度与寡核苷酸片段长度有关。
（1）14碱基——37℃
（2）17碱基——48℃
（3）20碱基——55℃
（4）23碱基——60℃
10. 如果滤膜高于本底放射性活性，则需要将洗膜温度升高2~3℃，并延长洗膜15~ 30 min。
11. 重新作放射自显影检测。但不得超过以下对应的温度：
（1）14碱基——41℃
（2）17碱基——53℃
（3）20碱基——63℃
（4）23碱基——70℃
12. 用塑料薄膜包裹滤膜，放好，使用增感屏在-70℃对X光片曝光14~72 h，双份滤膜均对X光片曝光，如果在同一位置出现曝光点，那么该位置对应的细菌菌落或噬斑为阳性。
实验材料 寡核苷酸
试剂、试剂盒 LBSDSEDTATMAC
仪器、耗材 水浴锅离心机培养箱尼龙膜
实验步骤
1. 按“在氯化钠/柠檬酸钠中杂交"介绍的方法处理已影印细菌菌落的滤膜。
2. 按下列方法制备带扩增噬斑的滤膜
（1）从文库中以渐减密度〔15 000~8 000噬斑 / 150 mm 平板）的方式将噬菌体铺在琼脂糖平板上。
（2）37 ℃培养至长出可见的噬斑。
（3）将噬斑影印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜后，滤膜移至预热的LB琼脂糖平板上，37℃培 养5~12 h（转印后冷室保存主平板）。
（4）将影印到膜上的噬菌体DNA变性并使之结合到滤膜上。
3. 转印细菌菌落的滤膜按“在氯化钠/柠檬酸钠中杂交"的步骤1洗膜，然后将滤膜浸入50℃ 2×SSC / 0.5%SDS / 50 mmol/l EDTA，pH8.0溶液中洗涤，尽可能冼去滤膜上影印的细菌残渣，然后用同洋的溶液再洗1遍。
4. 按每张滤膜5~10 ml 预温的TMAC杂交液量，在15 cm 玻璃水晶盘中可移入多达30 张的滤膜，用塑料保鲜膜将玻璃盘封好。
5. 在杂交温度下预杂交1 ~2 h。杂交温度和洗膜温度均应比解链温度低5~10℃。
6. 预杂交后，将滤膜转移到一个装满新鲜、预热的TMAC杂交液的杂交容器中。
7. 并按毎毫升杂交液加入1×106~2×106 cpm35P标记的寡核苷酸探针，于适当的温度下温育40~60 h。
8. 室温下每张滤膜先用5~10 ml TMAC洗液洗涤，然后分别将滤膜转移到200~ 250 ml 新鲜的TMAC洗液中，轻轻振荡洗涤15 min。
9. 换上等体枳预热的TMAC冼膜液，在适当的洗膜温度下温育1 h。
10. 再用等体积的2×SSC / 0.1%SDS洗膜液在室温下洗膜，共3次，每次约10 min，以去除TMAC。
11. zui后按“ 在氯化钠/柠檬酸钠中杂交"进行放射自显影。
