支原体污染检测试剂盒(PCR法)
(PCR Mycoplasma Detection Kit)
Cat number：YS012
Store at -20℃ for one year
Expire date：
For Research Use Only
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支原体污染检测试剂盒(PCR法)一、试剂盒说明
本试剂盒通过PCR 法对细胞培养物、动物分泌物等多种生物材料进行支原体污染检测。常
规培养法进行支原体检测一般需要几天的时间，而本试剂盒通过PCR 扩增及电泳分析进行
支原体检测只需几个小时，方便快捷。本试剂盒的多对引物能特异性扩增多种支原体rRNA
基因片段，一次就可以检测至少11 种的支原体，包括M. fermentans，M. hyorhinis，M. arginini，
M. orale ， M. salivarium ， M. hominis ， M. pulmonis ， M. arthritidis, M. neurolyticum, M.
hyponeumoniae, M. capricolum 等。其原理是原核生物的rRNA 碱基序列非常保守，而rRNA
操纵子上编码rRNA 的DNA 间隔区如16S 和23S 间隔区，各种生物种间的碱基序列差别很
大。这个间隔区的DNA 序列及长度在支原体各个种间既有相对保守的部分，也有具有很大
差异的部分。因此可以在编码16S 和23S rRNA 的DNA 上设计一对引物，扩增编码16S 和
23S rRNA 的DNA 间隔区，然后在编码16S 和23S rRNA 的DNA 间隔区的保守区上设计一
条引物，在编码23S rRNA 的DNA 上设计一条引物进行嵌套式PCR。能特异性检测出支原
体DNA，检测灵敏度与特异性都很高。
支原体污染检测试剂盒(PCR法)二、试剂盒组份
组份YS012(20 assays) 储存条件
10×Taq Buffer(不含Mg2＋) 1.0 mL -20℃
MgCl2(25mM) 1.0 mL -20℃
Taq DNA Polymerase(5 U /μl) 100 U -20℃
Myc F1 Primer (10μM) 50μL -20℃
Myc R1 Primer(10μM) 50μL -20℃
Myc F2 Primer(10μM) 50μL -20℃
Myc R2 Primer(10μM) 50μL -20℃
Control Template(1 ng/μl) 50μL -20℃
DNA 溶解液2 mL -20℃
ddH2O 5 mL -20℃
三、试剂盒以外自备仪器和试剂
离心机、微量移液器、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像仪、dNTPs(10mM)、琼脂糖、溴化乙锭
等
四、使用注意事项
整个实验，应规范操作，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR 扩增应分区域进行，以
避免交叉污染。
支原体污染检测试剂盒(PCR法)五、操作方法
1.收取待检样品(细胞一般生长至80％左右即可，贴壁细胞不宜用消化液消化细胞，可以使
用细胞刮刮取细胞)，然后取细胞悬液200ul(约1～3×105 细胞数)至离心管，12000rpm 离心
5～10min；去上清，加入50ul DNA 溶解液，充分悬浮沉淀物，沸水浴5min；样品使用前
12000rpm 离心5～10min，取上清4ul 作为PCR 反应模板；剩余样品可以-20℃保藏。样本
有时也可以直接用污染液直接做PCR 反应。
2.PCR 反应
*步PCR：
50μL 体系PCR 反应(如客户需要使用更小量的反应体系，试剂加样量按比例进行减少)：
(1)．使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm 离心20s；
(2)．取灭过菌的0.2mL 离心管，在冰上依次加入
10×Taq Buffer 5 μL
dNTPs (10mM) 1 μL
MgCl2 (25mM) 4 μL
Myc F1 (10μM) 1 μL
Myc R1 (10μM) 1 μL
DNA 样品1~5 μL
Taq DNA Polymerase 0.5 μL
ddH2O up to 50 μL
(3)．轻轻混匀，2000rpm 离心20s；
(4)．进行PCR 扩增
PCR 扩增条件：
94°C，5min；
94°C，30 sec；55°C，2min；72°C，1 min；32 Cycles；
72°C，10 min，
第二步PCR：
50μL 体系PCR 反应(如客户需要使用更小量的反应体系，试剂加样量按比例进行减少)：
(1)．使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm 离心20s；
(2)．取灭过菌的0.2mL 离心管，在冰上依次加入
10×Taq Buffer 5 μL
dNTPs (10mM) 1 μL
MgCl2 (25mM) 4 μL
Myc F2 (10μM) 1 μL
Myc R2 (10μM) 1 μL
*步产物1~5 μL
Taq DNA Polymerase 0.5 μL
ddH2O up to 50 μL
(3)．轻轻混匀，2000rpm 离心20s；
(4)．进行PCR 扩增
PCR 扩增条件：
94°C，5min；
94°C，30 sec；55°C，2min；72°C，1 min；32 Cycles；
72°C，10 min，
3.反应结束后，取反应液10μL 进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR 反应产物。如果此PCR 产
物需用于以后实验，应将PCR 产物冷冻保存。
4.根据感染支原体类型的不同，扩增产物大小有所不同，*步PCR 产物在350～700bp 之
间，第二步PCR 产物在150～250bp 之间。支原体污染检测试剂盒(PCR法)
