1．准备好凝胶滤柱以便完成结合反应后用于分离标记抗体和游离的荧光色素。分离球形蛋白使用排除极限为20 000～50 000的凝胶介质和细粒级凝胶（直径约50μm）。所需凝胶滤柱的大小可根据偶联反应的总体积×20来确定。依据厂家说明准备好滤柱，用20倍柱床体积的PBS灌注滤柱，直至缓冲液水平刚好降至低于柱床顶部，关闭滤纸底部的阀门或用塑膜黏土（或parafilm）封闭底端以使滤柱不再流动。

2．用0.1mol/L的硼酸钠或碳酸钠配制浓度至少为2mg/ml的抗体溶液（pH9.0）。应避免引入含一级胺的外来分子。

3．用无水DMSO（优级纯）溶解FITC或TRITC至1mg/ml。每次标记反应时新鲜配制。

4．每1ml蛋白溶液加50μl染液。染液须以每次5μl缓慢加入，加入时应轻轻地连续搅拌混匀。

5．置4℃避光反应1h。

6．加氯化铵至50mmol/L，室温孵育2h。加入0.1％二甲苯氰和5％甘油。

7．通过凝胶过滤分离结合物与未结合的染料。小心地将偶联反应产物加在滤柱顶部，打开阀门使抗体溶液流过滤柱直至刚好进入柱床。再小心地将PBS加在滤柱顶部并与缓冲液供应装置连接。结合染料的抗体首先洗脱，通常可在室光下见到。

8．将洗脱液的结合物4℃贮存于避光容器，必要时加入0.02％叠氮钠。

9．进行荧光素偶联反应时，应通过测量495nm和280nm波长的吸光值计算荧光素和蛋白的比率，罗丹明的测量波长在550nm和280nm。荧光素的吸光值比例（496nm/280nm）应在0.3～1.0之间，罗丹明的吸光值比率（550nm/280nm）在0.3～0.7之间。低于上述比率将导致低信号，高比率则出现高背景。若比率太低，应使用低浓度抗体与高浓度染料重复结合；若比率太高，则可适当调整后重新标记，或通过DEAE离子交换层析柱进一步纯化抗体。用10mmol/L 磷酸钾（pH8.0）平衡并灌注滤柱，通过增加盐浓度进行梯度洗脱。