化学致癌物诱导细胞转化实验

(1)原理：化学致癌作用(chemical carcinogenesis)是指化学物质引起或诱导正常细胞发生恶性转化并发展成肿瘤的过程。通过细胞表型的改变，反映各种理化因素的致癌性，同时，可模拟化学致癌物在体内致癌的过程，并可对发生转化的细胞做直接观察和各种分析。其中以叙利亚地鼠胚胎初代培养细胞较为常用，现在以N一甲基一N'一硝基一N一亚硝基胍(MNNG)进行细胞转化实验为例。

(2)材料

1)动物：鼠(如：叙利亚地鼠，金仓鼠等)。

2)细胞生长液：含20％小牛血清的RPMI 1640或MEM培养液。

3)维持液：含5％小牛血清的RPMI 1640或MEM培养液。

4)消化液：O．25％*(含O．01％EDTA)。

5)冻存液：含lO％小牛血清的DMSO。

6)致癌剂：MNNG。

7)洗液：PBS。

(3)方法

1)取材：妊娠第13天鼠，取数个同窝胚胎，去头和内脏，在无菌条件下剪碎至米粒大小，再用0．25％*(含O．Ol％EDTA)37℃消化30min，滤过，低速离心，吸除消化液，加入营养液制备成细胞悬液，接种人75cm培养瓶中，接种密度为10～20×106／75 cm，37℃培养2～3d。

2)贮存：选大批生长状态良好的细胞冻存。

3)致癌物处理：取冻存细胞，解冻后接种于25ml培养瓶中，每瓶含细胞10万～30万。待细胞生长进入指数增生期时，加入含0．5～1．Omg／L MNNG的*培养基，在37℃孵箱中培养12～48h。

4)低血清培养：弃掉MNNG致突变剂，用温PBS洗2～3次，加入含20％小牛血清，继续置温箱中培养2～3周，然后改用含5％血清培养液培养。低血清培养液不利于正常细胞牛长，但已转化的细胞仍能增殖和形成转化灶。

5)转化灶的形成：用致癌物处理过的细胞于10d后在正常细胞之间，可产生数量不等的转化灶。转化灶由密集而重叠的细胞组成。在透光检查时，肉眼可见有大小不等的白色斑块转化灶。显微镜下观察，未转化的成纤维细胞转化后，胞体增大，成多边形，生长无方向性，失去接触抑制，向三维空间延伸排列，细胞相互重叠。在转化灶边缘，转化细胞与正常细胞界限分明，形态区别相当明显。上皮细胞转化后形态变化不如成纤维细胞差别大，需仔细识别。

6)转化细胞的分离：将培养瓶放在倒置显微镜下观察转化细胞，将转化灶用记号笔标记。用细胞刮去除未发生转化的外圈正常细胞。向瓶内加入PBS清洗3次，再加入消化液．37℃下消化数分钟。镜下观察细胞变圆时，加人含10%小牛血清的*培养液，反复用吸管吹打分散，制成细胞悬液，分瓶培养。成单层后，再用传代法扩大培养。

(4)转化细胞观察与鉴定：转化灶由密集而重叠的细胞组成。肉眼可见有大小不等的白色斑块转化灶。显微镜下观察，成纤维细胞转化后，胞体增大，成多边形，生长无方向性．失去接触抑制，向三维空间延伸排列，细胞相互重叠。在转化灶边缘，转化细胞与正常细胞界限分明，形态区别明显。上皮细胞转化后形态变化不如成纤维细胞差别大，需仔细识别。