一、同位素法

    51 Cr释放法(以CTL为例)51Cr释放法是用铬酸钠(Na51CrO4)标记的靶细胞与致敏淋巴细胞一起培养，靶细胞被CTL杀灭后，51 Cr即释放到培养液中，测定释放到培养液中51 Cr的脉冲数(cpm)即反映出CTL杀靶细胞的程度。

(一)材料

1．新鲜的外周(肝素)抗凝血液。

2．靶细胞(通常选用传代的肿瘤细胞如K562)。

3．RPMI 1640培养液、PBS缓冲液。

4．闪烁计数器。

(二)方法

1．短期标记法

(1)用RPMI 1640培养液洗涤107个靶细胞，去上清液。用O．5ml不含*的*培养液悬浮细胞。加入100μCi(3．7MBq)51Cr铬酸钠，37℃水浴中标记1h，每5～lOmin摇晃一次，混匀细胞。

(2)如上用RPMI 1640培养液洗涤细胞3次，每次1000 r／min离心10min。用50mlRPMI 1640培养液悬浮细胞，置37℃水浴30min，以减少非特异的自然释放。

(3)1000r／min离心10min，去上清液。小心用RPMI 1640培养液悬浮细胞，尽量减少振荡引起的细胞损伤以降低靶细胞的自然释放率，将细胞浓度调整为O．5×105／ml或l×105/ml备用。

2．51Cr释放实验

(1)在96孔l圆底细胞培养板中加入51Cr标记的靶细胞，每孔加100μl。

(2)向各孔加100μl效应细胞(利用淋巴细胞分离液分离得到的淋巴细胞)，效应细胞与靶细胞的比例(E：T)根据要求而定，通常为5：l～20：l。阴性对照孔(自然释放)不加效应细胞只加100／~1*培养液，阳性对照7L(zui大释放)中加lOOμl1％NP40(或2%SDS，1mol／L盐酸)。每个实验置3个复孔。

(3)1000r／min离心，3min后，置37℃5％C02的二氧化碳培养箱中培养4h。

(4)离心培养板1500r／min 10min，每孔吸出100μl上清液置一次性使用的检测管中，在γ计数仪上(或液闪计数仪上)测定上清液中的每分钟放射性活性(cpm值)。

(三)结果分析

    特异性杀伤活性的计算。

1．用细胞毒性百分比表示

    一般自然释放率>15％，对照释放率<5％，而特异性释放率>10％才有意义。

2．用溶解单位(Lu)表示一个Lu是指能溶解一定数量靶细胞的效应细胞数。通常将能溶解30％靶细胞的效应细胞数定为一个Lu。结果以l06个效应细胞所具有的Lu数表示：Lu30／106细胞=106／[(E：T30)×(每孔靶细胞数)]，E：T30是该效靶比时效应细胞能杀伤30％靶细胞。