HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成Schiff碱。为了防止酶蛋白的氨基与醛基发生自身偶联，在标记前先用2，4-二硝基氟苯（DNFB）封闭酶蛋白中残留的a-和e-氨基。酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠还原成稳定的结合物。

（1） 取HRP 5mg溶于0.2mol/L，pH5.6醋酸盐缓冲液1ml中，加入1%DNFB无水乙醇溶液0.1ml，室温下轻微搅拌1h；

（2） 加入新鲜配置的0.1mol/L NaIO4 0.5ml，此时溶液由原棕色变为墨绿色，置4℃放置30min，此时溶液由原棕色变为墨绿色；

（3） 加入2.5%乙二醇1ml， 室温下轻微搅拌1h，终止反应；

（4） 加入待标记的抗体5-10mg， 用1.0mol/L， pH9.5 CBS，调节pH值至9.0；

（5） 混匀，置4℃过夜改良过碘酸钠标记法制备酶标抗体

（6） 加入硼氢化钠溶液0.1ml，混匀，4℃放置3h；

（7） 对0.01mol/L，pH7.4 PBS，4℃透析过夜，换液3次；

（8） 3000r/min离心30min，去除沉淀物；

（9） 收集上清液即为酶标记抗体。

【注意事项】

（1） 在氧化HRP时，以pH5.6醋酸盐缓冲液溶解酶为宜。

（2） 一般认为氧化HRP 5mg， NaIO4量以0.06mol/L 0.5ml为宜，不能低于0.015mol/L 0.5ml。

（3） 氧化HRP时间以15-30min为宜。

（4） 加入DNFB的目的是为了封闭酶蛋白中残留的a-和e-氨基。

（5） 加入乙二醇的目的是终止反应；为便于在加入抗体后调pH值，故乙二醇要用0.05mol/L CBS配制。