1.氟化钠、钒酸钠和焦磷酸盐经常用做磷酸酶抑制剂，而*抑制剂、亮肽酶素和苯甲基磺酰氟化物用做蛋白酶抑制剂。这种缓冲液里所用的抑制剂全部具有一定程度的毒性，使用时应该小心操作。这些抑制剂可能不足以抑制所有蛋白的酶修饰，同时如果不需要的话也可将它们去除或替代。

2.ProteinA是一个葡萄球菌属的蛋白，它结合到抗体分子的保守位置，亲和力决定于种属和抗体的类型。有一个类似ProteinA的分子是ProteinG，可以用于不同的抗体类型。一个实用的选择规律是将Pro-teinA用于兔来源的抗体，而ProteinG用于鼠来源的抗体。在本章中，PAS可以是ProteinASepharose或 ProteinGSepharose。

3.除了用转染的细胞，还可以用细胞系或组织表达的内源蛋白做免疫共沉淀。这样做的优势是避免了过表达对细胞内环境的改变，并且消除了外来的接头和标签序列。然而，这类免疫共沉淀实验将更加困难，因为需要细胞表达足够多的内源性目标蛋白才能满足高质量抗体的需要，并且实验中缺乏好的阴性对照。本章列出的免疫沉淀过程可以作为一个实验起始点，但是各种来源的细胞裂解物、各种抗体以及与种属和匹配类型不相关的抗体应该被提前检测是否能与感兴趣蛋白发生特异性的相互作用。此外，如果蛋白相互作用可能被药物的刺激或细胞的培养条件影响，那么应该在免疫共沉淀实验中加以验证。

4.这个方法中常用HEK293细胞，因为这种细胞易于培养并且转染效率高。如果需要也可使用其他合适的细胞系。

5.除了数细胞个数，也可以用裂解物做蛋白浓度测量。如果样品量大，这种做法非常方便。在免疫共沉淀时，用一种样品的大约一半裂解物来作为其他样品的等量对照，这样各组容易获得平均的蛋白量。

6.由于PAS的相对惰性以及Westernbloting对目标蛋白特异的检测意味着在很多情况下，预清除步骤并不是必须的。为了节约时间和成本，实际实验中经常将这步省略。但在*次尝试一个特殊的免疫共沉淀时加上这步。

7.方法中列出的抗体和PAS的用量与细胞裂解物的量高度相关。这些量的选择应该能够zui大程度地沉淀诱饵蛋白。注意，大量的PAS更加容易沉淀复合体并能减少因为少量 PAS珠子流失所造成的影响。但是，这些试剂非常昂贵，所以在很多情况下可以尽量减少抗体和PAS的用量，用量对于不同系统有很大差异，应根据经验选择。

8.处理PAS应该注意一些技术。因为缓冲液可能会挥发，所以在从储存瓶中取PAS珠子之前，应该先将瓶子平放并确认有几乎等量的珠子和储存缓冲液。如果储存缓冲液变少了应该加入更多的储存缓冲液（见包装内描述）。在吸取悬浊液时，用开口较大的tip头或将tip头末端用刀片切掉。注意，离心很容易将PAS破坏，因此一定要用低速或者短时离心。在洗涤过程中，注意不要吸到珠子，也不要让珠子干透。zui后，一次只准备足够一次实验的珠子，因为珠子长时间储存在裂解缓冲液中会降低它与抗体的结合能力。

9.Westernblotingzui常用的IgG抗体是由两条重链（大约50kD）和两条轻链（大约25kD）组成的异源二聚体，重链与轻链依靠二硫键相连。当煮沸PAS收集感兴趣的蛋白复合物时，大多数抗体将一起从珠子上洗脱，造成zui终样品中有大量抗体蛋白污染。如果洗脱液中含有还原剂，抗体将几乎都以50kD和25kD的条带存在；如果没有，它们将主要出现在150kD但是50kD和25kD蛋白依然非常显著。这就成为标记Westernbloting的一个问题，因为Western的二抗通常是与过氧化物相连的抗IgG。如果免疫沉淀中的俘获抗体和Western检测用的一抗是同一种属，被洗脱下来的俘获抗体也能被二抗识别，这将产生非常强的干扰信号，因此免疫沉淀中的俘获抗体和Western检测的一抗应该选择不同种属的抗体。即使这样，与抗体成分分子量相近的蛋白可能造成干扰，因为Western的二抗经常对不同种属的IgG产生交叉反应。如果这个问题无法通过在洗脱液中加入或去除还原剂来克服，另外可能的解决办法一是跑长一些PAGE胶使感兴趣的蛋白与俘获抗体在物理上分离，二是用共价交联在珠子基质上的俘获抗体。