免疫组化试剂的标准化

    要求试剂公司提供标准化的试剂，并附详细的试剂说明书，包括抗体的来源、免疫球蛋白的亚类、单抗或多抗、使用稀释度、使用流程和注意事项、洗涤时缓冲液的适宜离子强度和PH值等。抗体的选择是开展免疫组化zui重要环节之一。目前，抗体大部分来源于国外，抗体种类繁多，生产厂家各异，再经过中介渠道致有效期缩短，影响抗体效价甚至阳性不表达，因此对购入的抗体首先要进行检测。理想的抗体应具备特异性强、敏感性高和适应性强的特点。

    现实市场销售的一抗多为即用型，对抗体的滴度无须摸索，但对于浓缩型一抗，则应摸索出*的工作滴度，抗体的浓度过高或过低都将可能出现阴性结果，应该用一个适当的稀释度得到*的抗原染色强度和zui低的背景着色。灵敏度高而极易控制背景的检测系统试剂盒是zui为理想也是免疫组化染色优劣的关键，根据免疫组化技术发展至今第三代SP试剂盒更优于其它试剂盒 (ABC、PAP等)。但应注意检测系统应与一抗来源相匹配，否则检不出目的物。一抗的作用时间是4℃过夜，也可以用37℃*lh，但后者在染色过程中应控制好温度、时间及其它抗体稀释度。

（1）抗体选用：一般来讲，多克隆抗体的抗原专一性较差，非特异性反应较明显，效价不太稳定；但多克隆抗体制备简便，价格低廉，抗体效价较高，稀释度一般在1∶100~1000之间，适应性强，有部分多抗表达抗原特异性较好，如TG和PSA等，多抗CD3对石蜡切片标记T细胞适应性强，阳性率高。单克隆抗体的抗原专一性强，质量和效价稳定，非特异性反应较少，标记结果可靠，但单克隆抗体制备复杂，价格昂贵，抗体效价较低，稀释度在1∶50~100，如单抗CD3只能在冷冻切片上表达，难在石蜡切片显色。目前市场上常有分装、稀释抗体出售，这种抗体有使用经济的优点，但稀释抗体减少了蛋白分子间互相保护的作用，因而效价不稳定，不易长期保存。进口试剂质量较好，但价格昂贵，特别是常用的第二抗体，染色过程短，敏感性高。因此，应根据实际需要选择合适的抗体。

（2）抗体分装：购入的抗体（除非只够数次用量）一般需要分装在多个安瓿中，根据月需要量，大致每安瓿含5~20微升。除留下一支现用，其余应立即放置低温冰箱内贮存（-20℃以下）。用一支取一支，以免长期保存在4℃冰箱内失效。

（3）抗体稀释：抗体使用一般按其工作浓度稀释，如1∶100，1∶1000等等。一次用不完的抗体可保存在4 ℃冰箱内，尽量在1~2月内用完，而不要放在4 ℃冰箱的冰格中，因为温度在0 ℃以下，抗体会很快结冰，再次使用时又要融化，这样几次冻融，抗体效价会急剧下降而失效。用作抗体的稀释液，在夏天温度很高时，加入少许防腐剂如叠氮钠、柳硫汞等，以免在切片上作用时间超过10小时而生霉菌。

（4）无菌与消：保持使用中的抗体无菌是困难的，但是与抗体接触的工具如滴管、吸管、试管、安瓿以及加样器等经过消毒，尽量减少污染的机会，不然抗体极易污染细菌与霉菌，而迅速发生浑浊沉淀而失效。