实验步骤

1. 蛋白质双向电泳

1) *向固相pH梯度等电聚焦电泳

a. 上样：*向等电聚焦采用胶内加样的方法进行。吸取一定量的蛋白样品(银染样品的蛋白上样量为140 ug计，考染样品为1.3 mg)加入重泡涨液(8 mol/L尿素，2%CHAPS，痕量滨酚蓝，20 mmol/L DTT，0.5 % IPG buffer)，使终体积达到350ul。混匀后均匀加在IPG胶条holder的正、负极之间。将预制IPG胶条(pH 3 -10 NL)除去保护膜，胶面向下，覆于holder中的样品之上；慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡。在胶条上方均匀封以1 ml覆盖油，盖上盖子。

b. 等电聚焦：将装有样品和IPG胶条的strip holder置一向电泳仪(IPGphorTM Isoelectric Focusing System)上进行等电聚焦。等电聚焦参数：0V电压下泡涨3h，30V电压下泡涨10 h，500 V电压下电泳0.5 h，2000V电压下电泳0.5 h，5000 V电压下电泳0.5 h，8000 V电压下电压20 h。

c. 胶条的平衡：*向电泳结束后，取出IPG胶条平衡两次，每次15 min。平衡缓冲液(50 mol/L Tris buffer pH 8.8，6 mol/L尿素，30甘油，0.8 g澳酚蓝，20 mmol/L DTT，含2 % (w/v) SDS)可减少电内渗，有利于蛋白质从*向转移到第二向。在第二步平衡中用100mmol/L碘乙酞胺代替DTT以除去*步平衡时的DTT。平衡后的IPG胶条沿边缘用滤纸吸去多余的平衡液。

2) 第二向垂直SDS-PAGE

     根据IPG conversion Kit的体积，配制大小为200 mmX200 mmX 1mm，浓度为12.5%T，3.3%C的均匀胶。将平衡好的IPG胶条移至凝胶上方，用0.5%琼脂糖电泳缓冲液封闭。电泳的缓冲液系统为Tris-Glycine-SDS系统(500 ml，SX，7.5 g Tris，2.5 g SDS，36 g Glycine)。一向胶条和二向胶接触面避免气泡产生；封胶温度不能过高，封胶时不要引入气泡。

    电泳参数设置：14-15℃恒温下，以每胶条计

    20 mA恒流电泳40 min

    30 mA恒流电泳至澳酚蓝电泳到底部。

2. 染色

1) 银染法：将二向电泳完成后的SDS-PAGE转移至固定液(40%无水乙醇，10%冰醋酸)中，固定30 min；弃固定液换敏化液(30%无水乙醇，6.8%醋酸钠，0.2%*，0.5%戊二醛)敏化30 min；弃敏化液，以双蒸水200 ml洗2次，每次30 min；之后置于银染液((0.25%*，40%甲醛)染色20 min，染色时避光；弃银染液，以双蒸水200ml洗2次，每次1 min；显色液((2.5%碳酸钠，20%甲醛)显色2-5 min，至蛋白质点*显现为止；弃显色剂，立即换终止液(1.46 %EDTA)，终止显色10 min；以超纯水洗3次，每次5 min。

2) 考马斯亮蓝染色(考染)法：将二向电泳完成后的SDS-PAGE转移至固定液(50%无水乙醇，10%冰醋酸的水溶液)中，固定30 min以上；弃固定液，加入染色液(10%冰醋酸，G-350过滤所得)，热染10 min；之后转移至脱色液中(10%冰醋酸水溶液)过夜，直至背景色脱尽；超纯水清洗。