(一)试验原理

    葡萄糖在细胞内的转运系统包括细胞膜、胰岛素受体和葡萄糖转运载体等。胰岛素和某些降血糖药对该系统具有激活作用，可促进葡萄糖转运，从而调节糖代谢。本实验通过离体睹肪细胞与2一脱氧一3 H一葡萄糖或3一O一3 H一甲基葡萄糖温孵，检测脂肪细胞对葡萄糖的摄取情况，观察待测药物对其影响。

(二)材料

1．待检药物进行不同倍数稀释。

2．阳性对照药胰岛素。

3．动物140～200g SD或Wistar雄性大鼠1只。

4．试剂及配制

(1)盐贮存液：称取NaCl 76．74 g，KCl3．51g．MgSC4·7 H20 3．63 g，CaCl2·2H2O3．63 g，溶于1000ml蒸馏水中，4℃保存(2周)。

(2)HEPES贮存液：称取HEPES 23．8g，NaH2PO4·H2O 42g，溶于1000ml蒸馏水中，pH调至7．6(20℃)，4℃保存(2周)。

(3)10%白蛋白贮存液：称取100g白蛋白(Ⅱ、Ⅷ型)，溶于500ml蒸馏水中，放置过夜后透析12 h(4℃)，加水至1000ml。用滤纸过滤1次后，用O．8μm微孔滤器再次过滤·应使溶液保持低温。pH调至7，4，分装后一20℃可存放1年以上。

(4)缓冲液：1：10盐贮存液、l：10 HEPES贮存液、一定量白蛋白贮存液(0．5％～5％)，蒸馏水加至终体积。

(5)胶原酶缓冲液：胶原酶(Ⅱ、Ⅷ型)缓冲液含O．5mmol／L葡萄糖、3．5％BSA．浓
度为0．5 mg／ml，pH调至7．4(37℃)，一20℃可存放4周。

5．器材37℃水浴箱、电磁搅拌器、50ml塑料烧杯、300μm尼龙筛、圆底塑料试管。

(三)实验方法

1．脂肪细胞的分离与制备

(1)断头处死大鼠后打开腹腔，取附睾脂肪垫，将脂肪垫用剪刀剪成I～2 min。大小置于含3ml胶原酶缓冲液(温度不低于25℃)的烧杯中。

(2)烧杯在30℃水浴温孵450min左右，低速搅拌l～2 min，使90％组织分散。

(3)将300μm尼龙筛折成漏斗状，置于圆底试管上，倒人细胞后用少量缓冲液冲洗。静置细胞l～2 min后，用长针头吸取试管底部的细胞碎片，加入10ml缓冲液后轻轻转动试管，去除下沉物，重复该过程3～4次。

(4)量取浓缩的脂肪细胞悬液，用缓冲液稀释到相应浓度。

(5)用显微镜检查制备好的脂肪细胞。将5μl脂肪细胞悬液稀释25～50倍后进行细胞计数和细胞大小测量，调细胞浓度为5×106／ml亦可采用锇酸固定后的细胞。

2．药物对细胞毒性的测定(药物无毒*的选择) 采用微量培养法。预先将上述细胞培养于96孔培养板内，置37℃5％CO2孵箱内，大约24h细胞成层后，弃去孔内培养液。再将递倍稀释(1：2，1：4…1：512)的0．1ml受检药物，分别加入成层的HeLa细胞孔内，每孔再补加O．1ml细胞培养液，每个浓度4孔，同时设细胞对照孔，置37℃5％CO2孵箱内培养，每天记录细胞病变结果，直至药物对细胞的毒性不再继续进展时判定结果，以不出现细胞病变的药物zui小稀释倍数为无毒*，计算出受检药的无毒*。

3．葡萄糖转运的测定取2～4×106个／800gl脂肪细胞置于培养管中，37℃水浴温孵：用生理盐水将胰岛素或待测药物从无毒*开始稀释成不同浓度，取4～8ul加到上述细胞悬液中。温孵30～60min后，加80μl 2一脱氧一3 H一葡萄糖(1．22×105Bq／μmol)，使其终浓度为100μmol／L，温孵3min。取200μl悬液，加入100“l邻苯二甲酸二辛酯后，8500r／min离心20s，分离油相细胞层，加5ml闪烁液后计数。

    细胞外放射性沾染的排除：将L一[14C]葡萄糖加入脂肪细胞悬液中，4℃放置3min。离心后取油相细胞计数，校正后数值即为脂肪细胞对2一脱氧葡萄糖的摄取值。

(四)结果与分析

1．胰岛素和某砦药物可直接促进脂肪细胞对葡萄糖的转运。

2．有些药物对葡萄糖的转运无直接作用，但与低浓度胰岛素(≤1nmol／L)共同孵育，可增强胰岛素促进脂肪细胞对葡萄糖的摄取作用。

3．非代谢的葡萄糖类似物3-O-3 H一甲基葡萄糖与脂肪细胞温浴后，用快速过滤法亦可测定脂肪细胞对葡萄糖的摄取。