ELISA试剂盒分析技术

ELIS试剂盒技术优势及应用  
     ELIS试剂盒的历史可以追溯到1963年Jerne等人创立的溶血空斑技术（hemo-lytic plaque forming cell assay，HPF），这项技术可用于检测并计数单个抗体形成细胞。随着单克隆抗体技术的成熟，1983年，Czerkinsky等采用此法检测脾细胞中分泌特异性抗体的细胞数，发现该方法敏感性高简便易行。后来，他们又用这种方法定量分析受到有丝分裂原刺激的外周血中分泌IFN2γ的细胞数。随后，用ELISPOT法在单细胞水平检测分泌其他细胞因子（如IL-2，IL-4，IL-5，IL-10，TNFα和IL-6） 数量的手段也被建立起来。Nordstrom等用*-抗*蛋白生物放大法来提高这种方法的敏感性，Herr用计算机辅助图像分析系统（computer-assisted video image analysis，CVIA）自动分析TNF2α酶联免疫斑点的大小和数量，计算与负载抗原肽的靶细胞接触后外周血单核细胞（PBMC）中抗原特异性CD8+T细胞的数量，不但提高了对背景染色的分辨力也使大规模研究成为可能。Vaquerano等将数码相机和计算机结合起来，开发出类似的斑点计数系统，认为当每孔斑点数大于100时，这种方法更客观、可重复性高且节省时间。  
       随着ELIS试剂盒技术的不断发展，它的优势也渐渐显示出来，下面将列举ELISPOT对比其它一些传统技术的优势所在。  
      ELIS试剂盒 分析使单细胞分泌产物可视化。这些分析异常敏感，因为它是在直接在分泌细胞的周围进行捕捉，而且是在表面被冲淡，或者被临近的细胞上的受体捕获，或降解之前。zui低至1：100万细胞精度的活体外频率测量。这种分辨率已经远远超过使用细胞内细胞因子的四聚物染色和ELISA法测量的精度。这种高敏感度是非常关键的，因为抗原特异性 T 细胞在体外都是典型性的低频率。高产量T细胞分析成为可行。一个经过训练的相关实验室小组可以测试成百的样本中几十种抗原的反应。只需要少量细胞，就可以用于通其他细胞学分析方法进行比较。例如，45毫升的血液就足以用于测试600种不同抗原/肽类物质的反应。可以定义CD4和CD8细胞的免疫因子指标。这是因为只需要少数细胞，分析就可以在高产量模式下进行。ELISPOT分析在筛选肽库，绘制免疫因子方面是一个理想的工具。 用于确定抗原特异性T细胞的功能性亲和力。这zui大可能受到肽类药物刺激至50%的影响。可以用于研究未经药物处理过的细胞的分泌过程。如果观察到净产量减少，可以确定这种区别是来自分泌细胞的减少，还是每个细胞分泌产量的减少。淋巴细胞在ELISPOT分析后依然存活。这使得分析之后进行增值，用于更进一步的分析、克隆或者低温储藏成为可能低温储藏后的人类淋巴细胞可以用于检测，而不会丢失其功能。治疗前和治疗后的样本可以并排进行测试，结果可以重复。  
（1） 与ELIS试剂盒  
       ELIS试剂盒 通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过计算机辅助的分析系统对斑点进行计数， 1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。捕获抗体具有高亲和力、高特异性、低内毒素的单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。   
与有限稀释法（limiting dilution analysis，LDA）  
       LDA能够对特异性CTL细胞进行定量，曾在很多年中被认为是CTL 检测的“金标准"，它使人们能够详细了解免疫反应动力学和记忆毒性T淋巴细胞（memorial CTL， mCTL） 亚群的细胞周期。但该方法需要高强度抗原刺激， 这会加快效应CTL（eCTL）凋亡，且不能定量测定eCTL细胞数量或测定值偏低。其次，该方法较繁琐，培养时间可长达2～3周，而且很容易造成T细胞数量损失。  
（2） 与四聚体法（Tetramer）  
       zui近几年出现了MHC2Ⅰ类分子抗原肽四聚体法。该法的优势在于迅速、直接、灵敏且特异性强，即使当体内mCTL水平低于1%，用MHC2Ⅰ抗原肽四聚体法仍可直接测到准确的值，比LDA 敏感度要高5～10倍。但该技术也存在较多应用上的困难：除了合成及稳定MHCⅠ类分子的技术困难外，zui主要缺点是表位的选择。由于每次反应只能分析单一的抗原表位，而MHCⅠ类分子结合的各种表位，能否形成CTL反应，却随着基因背景及时间的变化而变化，因此选择正确的表位就显得尤为重要。优势表位的筛选可以通过Elispot 来进行，但对整个肽库进行扫描，并不是一件很容易的事。当然，生物信息学的运用对表位的筛选有很大的帮助。同时，有研究结果表明，并非所有经过Tetramer 鉴定的阳性细胞都有确切的功能， Tetramer阳性的细胞数是用ELISPOT分析能分泌INF2γ细胞数的10倍，其中很多是不表现功能的惰性细胞，可能代表了记忆型CTL前体细胞。Tetramer分析只增加了分析的灵敏度，同时测定其功能很重要。  
（3） 与Cr51释放法  
       此法是一种比较经典的方法，虽然在检测CTL识别的抗原多样性方面非常有效，且能阐明被CTL识别的*表位，但至多为半定量的层面，而且Cr51标记细胞的自发释放率较高，不适于较长时间培养；标记时所需的细胞浓度较高，因而给试验带来诸多不便；此外，Cr51释放法所测定的是一个细胞群体的特性，而不是单个细胞。  
（4） 与胞内CK染色法  
       与ELISPOT法相比较，胞内CK染色法（intra-cellular CK staining，ICS） 主要应用细胞内累积细胞因子的染色和多色参数的FACS法，是检测循环淋巴细胞中抗原特异性T 淋巴细胞的可行方法，而ELISPOT法却可以检测所有分泌CK的eCTL 。  

应用  
       目前，ELISPOT已被用于检测药物、化学制剂及其它CK复合物的特性及功能等方面，因此为体内免疫功能的调节效应提供了检测依据。近几年来， ELISPOT技术在肿瘤疫苗评价试验、免疫监测及免疫学研究中越来越被广泛地使用。  

（1） 在抗肿瘤免疫及相关领域中的应用  
      在许多研究中，该技术已被用于免疫动物外周血淋巴细胞中抗原特异的细胞毒性T细胞（CTL）的数量检测。近期，ELISPOT技术已用于分析和评价从传染病病人的PBMC中检测肽特异的T淋巴细胞以及在癌症病人中诱导肿瘤特异的T细胞的疫苗试验。  
ELISPOT检测T细胞反应时敏感性、特异性和可重复性都很高，操作简单迅速，需要少量标本，在检测抗原特异性细胞数量的同时也反应其功能，并与临床结果相关。ELISPOT平板可以提前大量准备，移液、洗板和读板都可自动化，因而大批量检查也可做到快速。在与与其他方法的比较后，ELISPOT很可能成为定量分析肿瘤或病毒特异性的T细胞反应的。  
（2） 在抗感染免疫中的应用  
       CTL在抗病毒感染的免疫应答中占有主要地位，而CD4+辅助性T细胞亚群Th1/Th2的平衡在抵御病毒感染中起着同样重要的作用。在HIV研究方面，由MHC-1类分子加工的不同抗原经CTL识别并产生免疫应答在控制HIV-1感染中同样起重要作用。利用ELISPOT方法检测CK如IFN2γ就可以进一步了解到针对HIV特异的CTL应答及相关免疫信息。  
       此外，ELISPOT法还用于评价由HIV-1感染引起粘膜的CD4+T细胞免疫应答以及HIVgp 120g与霍乱毒素共表达的DNA疫苗的免疫源性。在其他研究中，ELISPOT还用来检测通过直肠免疫低剂量甲肝疫苗而产生的细胞免疫应答。在急性的自限性肝炎中，以Th1为主的应答促进细胞介导的免疫，且在控制病毒感染及延缓慢性疾病的发展方面有重要作用。  
       在许多抗细菌免疫研究中，该方法也发挥了重要作用。例如：应用ELISPOT试验证实表达大肠杆菌MalE蛋白的重组卡介苗（rBCG.MalE）诱导的T细胞应答是CD4+T细胞依赖的，rBCG.MalE 诱导的特异CD4+T细胞应答存在Th1/Th2平衡转换现象，并逐步形成Th1/ Th2 混合应答。  
（3） 临床方面  
       目前，已经实现临床检验的领域是对肺结核（TB）的检测。而zui近的研究热点就是对于移植的预测。受体对供体特异性HLA抗体一直以来都是器官移植的一大障碍，因为它们的存在不仅介导超急性排斥反应而且还可导致急性排斥反应。因此，HLA抗体的存在限制了异体抗原敏感患者对供体器官的需要，因而增加了等待移植的时间。在心脏，肝脏和肾脏异体移植后早期出现的并发症如急性排斥反应与移植前存在的异体免疫临床相关性迫切需要一种恰当的检测方法在器官移植前能了解受体对供体特异性体液免疫的功能状态。  
    在接受移植的人群中，部分因有多次输血、或既往有异体移植失败或多次妊娠史体内曾经存在阳性异体抗体，在他们接受异体移植时，现有的检测方法只能显示他们对异体的免疫功能正常。但他们体内存在记忆B淋巴细胞，一旦受到相应HLA 抗原的刺激则会唤起免疫反应，这不仅影响着移植的结果，甚至会出现危及患者生命的、与移植相关的并发症。  
    ELISPOT是一种强有效的检测单个抗体分泌细胞的方法，具有很高的敏感性。因此，刺激记忆B淋巴细胞增殖、分化成浆细胞，并建立一种特异性ELISPOT方法检测HLA抗体产生细胞是*手段。 如果ELISPOT要进一步推广应用，特别是临床应用，其标准化将是一个十分重要的问题。美国FDA和NIH等已经开始建立ELISPOT的标准化流程，相信随着ELISPOT技术的成熟、标准化程序的建立，它的应用将更加广泛。  



ELISPOT 实验方案  

对应BD的试剂盒  
实验材料的准备  
试剂盒中没有但是必须的  
材料:    
? 已消毒的移液器 （Gilson）。单道20ul,100ul,200ul,1ml, 8/12道200ul  
? 无菌一次性聚苯乙烯吸量管 （1ml, 5ml, 10ml）（Axygen）。  
? 一次性乳胶手套 。  
? 无菌一次性离心管（15ml、50ml）（Corning cat#430052 and 430290）。  
? 吸水纸（卫生纸）  
? 无菌tip头, 200ul,1ml,  

    试剂:  
1.        PBS 无菌 300ml/10板，有菌4000ml/10板 在准备包被抗体时不要使用商业化的PBS  
2.        ddH2O（无菌） 对于10块ELISPOT板，200 ml  
3.        有菌洗涤缓冲液（PBST）：有菌3000ml/10板  
Tween-20 进口  
4.        有菌洗涤缓冲液（PBS）：有菌1000ml/10板  
5.        培养液：无血清培养基 （P/S, 2 mM 的*，以及 Hepes buffer）。  
6.         PMA ＋ionomycin.  
    Phorbol 12-myristate 13-acetate （PMA; Sigma Chemical Co., product nr. P8139 is recommended）.  
PMA   
贮 存 液：PMA溶于DMSO，浓度为1mg/ml，-20℃保存  
工 作 液：贮存液 1:4000稀释于无血清培养基中  
此时为 250ng/ml   
 Calcium ionophore （ionomycin; Sigma Chemical Co, product nr. I0634 is recommended）.  
Ionomycin   
贮 存 液：Ionomycin溶于DMSO，浓度为1mg/ml，-20℃保存  
工 作 液：贮存液 1:200稀释于无血清培养基中  
此时为 5μg/ml   
50ml混合刺激剂＝PMA工作液12.5ul，Ionomycin工作液250ul，无血清培养基补齐  


7.        10% 热灭活胎牛血清 （Hyclone cat# ALH14384 ）  
8.        抗原  
       
设备:  
? 洗板器: 自动或手动 （洗瓶, 手动分液器等）。  
?CO2-细胞培养箱 （37°C）。  
4°C冰箱  
无菌间无菌操作台  



Preparation kit reagents    
1．包被用抗体  
取50 μl加到10ml PBS中。（足够包被1块96孔板，100 μl/well）。  
对10块板子， 500ul加到100ml PBS中  
2．*标记的检测抗体（detector antibody）  
取50μl加到10 ml  Dilution buffer中。（混匀后加入ELISPOT板，100 μl/well）。  
对10块板子， 500ul 加到100ml Dilution buffer（PBS+10%FBS）  
3．STREP-HRP  
取100μl加到10 ml  Dilution buffer中。（混匀后加入ELISPOT板，100 μl/孔）。  
对10块板子， 1ml 加到100ml Dilution buffer  

4 显色激活系统（Activation system）  
对于1块ELISPOT板，200ul AEC Chromogen + 10 ml AEC Substrate，混匀，10分钟内用完。（100 μl/孔）。  

ELSPOT实验步骤  
Day 1   
包被ELISPOT板 16：30  

1.        在ELISPOT板中每孔加入包被抗体100μl，4℃。  
Day 2  
ELISPOT板的封闭  17：00  

2.        取出已包被的ELISPOT板，吸弃每孔中的包被抗体溶液。  
3.        用*无血清培养基洗1次。  
4.        在ELISPOT板中，每孔加入200μl*无血清培养基。室温2h。（8道排枪）  
5.           
PBMC加入ELISPOT培养板 20：00  

6.        取出封闭2h的ELISPOT板，吸弃每孔中的封闭液。（不要洗板！）  
7.        在ELISPOT板中，先加30μl 无血清培养基（12道排枪）和20μl肽库（8道排枪），后加50μl细胞（8道排枪） （每孔活细胞总数为2×105，每个病人需活细胞总数为10×106，体积为2.5 ml。每条多肽的终浓度为5μg/ml，活细胞的工作浓度为4×106/ml，活细胞的终浓度为2×106/ml）。  
阳性孔中每孔加入50μl 细胞和30μl无血清培养基和20μl PMA+Inomysin（工作液浓度分别为250ng/ml和5ug/ml，终浓度分别为50ng/ml和1ug/ml）。  
8.        用low evaporation lid 盖好ELISPOT板，放入37℃ CO2孵箱培养30 h。  
注意：不要晃动ELISPOT板。 

Day 4   
二抗和GABA标记，显色反应 8：30  
9.        培养30h后，取出ELISPOT板，甩去细胞后。  
10.    用去离子水洗涤2次。每次浸泡5分钟。  
11.    用0.05％PBST洗涤3次。每次浸泡2分钟。  
12.    每孔加入100μl *化的detector Ab（8道排枪）。室温2小时。  
13.    取出ELISPOT板，倒去detector Ab溶液，用PBST洗涤3次。每次浸泡2分钟  
每孔加入100μl Strep-HRP溶液（8道排枪）。室温1小时  
14.    取出ELISPOT板，倒去Strep-HRP溶液。  
15.    PBST洗涤4次。每次浸泡2分钟。  
16.    用PBS洗涤2次。每次浸泡2分钟。  
17.    洗涤完毕后，在吸水纸上轻轻拍干ELISPOT板。  
每块板子200ul AEC Chromogen + 10 ml AEC Substrate，混匀，15分钟内用完。  
18.    每孔加入100 μl 配好的substrate（8道排枪）。在暗处、室温下孵育（5～60分钟）。  
出现斑点后，用自来水冲洗，中止反应。室温下干燥，检测。