过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物(PAP)的制备实验

实验试剂

1. HRP和兔(或羊)抗HRP：抗HRP用HRP免疫兔(或羊)获得

2. 0.075mol/L醋酸钠-0.15 mol/L醋酸铵等量混合液

3. 0.1mol/LHCl

4. 0.01mol/LHCl

5. 饱和硫酸铵溶液

6. 0.01mol/L NaOH

7. 60%甘油

实验设备

1. 高速离心机

2. 小烧杯

3. 电磁搅拌器

4. 冰箱

5. 透析袋

实验步骤

1. 取兔(或羊)抗HRP血清5ml，16000r/min离心20min，去沉淀；

2. 于收集的上清中加入HRP(2mg/ml)溶液1ml，室温缓慢搅拌1h，同上离心；

3. 沉淀物用冷生理盐水洗涤3次，弃上清；

4. 于沉淀中加入HRP(2mg/ml)溶液4ml，混匀后，移至小烧杯；

5. 边搅拌边加入0.1mol/LHCl(约10滴)，再用0.01mol/LHCl调pH值至2.4左右；

6. 待沉淀*溶解，溶液变清时，立即加入0.01mol/LNaOH将pH值调回7.4；

7. 同上离心，去沉淀；

8. 于收集的上清中加入1/10体积的0.075mol/L醋酸钠-0.15 mol/L醋酸铵等量混合液，混匀；

9. 在电磁搅拌下逐滴加入等量饱和硫酸铵溶液，并继续搅拌10min后，放4℃20min；

10. 同上离心，去上清，再用等量饱和硫酸铵溶液洗涤离心2次；

11. 将沉淀物溶于5ml生理盐水，并装入透析袋；

12. 用ph6.75醋酸盐缓冲液(13.5L生理盐水、1.5L蒸馏水、75ml 1.5 mol/L醋酸钠及75ml 3mol/L醋酸铵) 4℃透析3天，每天换液2次；

13. 同上离心，取上清进行鉴定。然后加等量60%甘油，小量分装，-20℃保存。

注意事项

1. 制备PAP时应预先选择HRP与抗HRP的等价带。

2. 应用抗HRP McAb制备PAP时，方法较为简单。据程明报道，用小鼠抗HRP McAb的腹水，按一定的HRP/IgG摩尔比(以4：1为宜)混合，置37℃水浴2h，即成鼠PAP复合物。而且由于抗HRP McAb与HRP形成的复合物均为可溶性的，因此不必加入过量的酶量。