ELISA常见问题及解决方案

做过一段时间的ELISA，总结了一些经验，供自己日后复习，也放在这里供大家参考。
 
症状：
1.  阳性与阴性不能达到2.1的比值，阴性颜色太深。
2.  阳性与阴性不能达到2.1的比值，阳性颜色太浅。
3.  增加抗原浓度，一抗浓度不变，显色反应没有表现出应有的梯度。
4.  增加一抗浓度，显色反应没有表现出应有的梯度。
5.  加完TMB显色后颜色梯度很明显，但加了硫酸终止反应后颜色梯度没有那么明显了。
 
可能问题：
1.  阴性对照（也就是阳性对照的除目标抗原外的其它成分）中有某种成分与一抗作用。
2.  1）一抗效价不好。
2）抗原太稀。
3）封闭时间过长。
3.  一抗与抗原的比例已经饱和。
4.  一抗与抗原的比例已经饱和。
5.  硫酸可能把其它成分都炭化了。
 
解决办法：
1.  纯化抗原除去干扰成分。
2.  1）换用一抗或增加一抗用量。
2）增加抗原浓度。
3）缩短封闭时间，封闭时间一般2小时以内即可。
3.  增加一抗用量; 或在一抗用量不变的情况下减少抗原浓度做梯度。
4.  增加抗原用量；或在抗原用量不变的情况下减少一抗浓度做梯度。
5.  加少一点硫酸，参考值：50 μlTMB+35 μl硫酸。
 
我认为一抗和封闭都是比较重要的步骤，如果ELISA还做不出满意的结果，可以从这两方面改进实验条件，能比较快地达到目的。