PCR操作范例及反应体系的组成

一、 PCR 操作范例 在一个典型的 PCR 反应体系中需加入：适宜的缓冲液、微量的模板 DNA 、 4 × dNTPs 、耐热性多聚酶、 Mg 2 和两个合成的 DNA 引物。模板 DNa 94 ℃变性 1min ，引物与模板 40 ～ 60 ℃退火 1min ， 72 ℃延伸 2min 。在循环前模板预变性 3 ～ 5min ；在末次循环后，样品仍需继续延伸 3 ～ 5min 以上，确保扩增的 DNA 为双链 DNA 。为便于了解 PCR 反应中各成份的组成，加入量和反应条件，使人们以此为基础，对不同的研究对象逐项改变来找到反应条件，特列举 Perkin Elmer Cetus 公司 Gene Amp DNA 试剂盒提供的典型反应条件供参考。  
表 22-1 PCR 反应混合液  
 

的总浓度为 0.8mmol/L ，低于 1.5mmol/L 的 Mg 2 浓度。因此，在高浓度 DNA 及 dNTP 条件时，必须相应调整 Mg 2 的浓度。 2 ． Tris -HCl 缓冲液在 PCR 中使用 10 ～ 50mmol/L 的 Tris – HCl 缓冲液，很少使用其他类型的缓冲液。 Tris 缓冲液是一种双极化的离子缓冲液， pKa 为 8.3(20 ℃ ), △ pKa 为 0.021/ ℃。因此， 20mmol/l Tris pH8.3(20 ℃ ) 时，在典型的热循环条件下，真正的 pH 值在 7.8 ～ 6.8 之间。  
3 ． KCl 浓度 K 浓度在 50mmol/L 时能促进引物退火。但现在的研究表明， NaCl 浓度在 50mmol/L 时， KCl 浓度高于 50mmol/L 将会抑制 Taq 酶的活性，少加或不加 KCl 对 PCR 结果没有太大影响。  
4 ．明胶明胶和 BSA 或非离子型去垢剂具有稳定酶的作用。一般用量为 100 μ g/ml ，但现在的研究表明，加或不加都能得到良好和 PCR 结果，影响不大。  
5 ．二甲基亚砜（ DMSO ）　　在使用 Klenow 片段进行 PCR 时 DMSO 是有用的；加入 10%DM － SO 有利于减少 DNA 的二级结构，使（ G C ） % 含量高的模板易于*变性，在反应体系中加入 DMSO 使 PCR 产物直接测序更易进行，但超过 10% 时会抑制 Taq DNA 聚合酶的活性，因此，大多数并不使用 DMSO 。  
 
二、四种脱氧三磷酸核苷酸（ 4 × dNTPs ）  
在 PCR 反体系中 dNTP 终浓度高于 50mmol/L 会抑制 Taq 酶的活性，使用低浓度 dNTP 可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度 dNTPs 易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。 PCR 常用的浓度为 50 ～ 200 μ mol/L ，不能低于 10 ～ 15 μ mol/L 。四种 dNTP 的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。  
决定zui低 dNTP 浓度的因素是靶序列 DNA 的长度和组成，例如，在 100 μ l 反应体系中， 4 × dNTPs 浓度若用 20 μ mol/L ，基本满足合成 2.6 μ g DNA 或 10pmol 的 400bp 序列。 50 μ mol/L 的 4 × dNTPs 可以合成 6.6 μ g DNA, 而 200 μ mol/L 足以合成 25 μ g/DNA 。  
购自厂商的 dNTP 溶液一般均未调 pH ，应用 1mol/l NaOH 将 dNTP 贮存液 pH 调至 7.0 ，以保证反应的 pH 值不低于 7.1 。市购的游离核苷酸冻 干粉，溶解后要用 NaOH 中和，再用紫外分光光度计定量。  
 
三、引物的量  
引物在 PCR 反应中的浓度一般在 0.1 ～ 1 μ mol/L 之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成! 
 
DNA 形成结合物，在紫外灯下能发射荧光，使 EB 的荧光强度增强 80 ～ 100 倍，所以，电泳后凝胶在紫外灯下可直接观察。一般肉眼观察 DNA 量可达 10ng ，其荧光强度与 DNA 含量成正比。 
  
30 个循环的扩增反应，则会降低 PCR 的产率。  
 
四、Taq DNA 聚合酶的量  
　　典型 PCR 反应混合物中，所用酶浓度为 2.5U/ μ l ，常用范围为 1 ～ 4U/100 μ l 。由于 DNA 模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，多聚酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。  
　　由于生产厂家所用兵配方、制造条件以及活性定义不同，不同厂商供应的 Taq DNA 聚合酶性能也有所不同。  
Cetus 公司酶定义是： 1 个酶单位是指在以下分析条件下，于 74 ℃， 30min 内使 10nmmol 的 dNTP 掺入酸不溶性成分所需的酶。测定时间为 10min ，折算成 30min 掺入量。  
　　分析条件为 25nmol/L TAPS （三羟基 - 甲基 - 氨基丙烷磺酸钠 pH9.3,25 ℃） ,50mmol/l KCl, 2mmol/L MgCl 2 ,1mmol/L β -ME （巯基乙醇）， dATP 、 dTTP 、 dGTP 各 200mmol/L ， dCTP 为 100mmol/L( 由不标记及α - 32 P 标记混合 ) ， 12. μ g 变性鲱鱼 DNA ，zui终体积 50 μ l 。  
 
五、模板  
　　单、双链 DNA 或 RNA 都可以作为 PCR 的样品。若起始材料是 RNA ，须先通过逆转录得到*条 cDNA 。虽然 PCR 可以仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞的 DNA ，但为了保证反应的特异性，还应用 ng 级的克隆 DNA ，μ g 水平的单拷贝染色体 DNA 或 10 4 拷贝的待扩增片段作为起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、 Taq DNA 聚合酶抑制剂以及能结合 DNA 的蛋白。  
DNA 的大小并不是关键的因素，但当使用*分子量的 DNA （如基因组的 DNA 时），如用超声处理或用切点罕见的限制酶（如 Sal 1 和 Not 1 ）先行消化，则扩增效果更好。闭环靶序列 DNA 的扩增效率略低于线状 DNA ，因此，用质粒作反应模板时先将其线状化。  
　　模板靶序列的浓度因情况而异，往往非实验人员所控制，实验可按已知靶序列量逆减的方式（ 1ng,0.1ng,0.001ng 等），设置一组对照反应，以检测扩增反应的灵敏度是否符合要求。  
 
六、石蜡油  
PCR 扩增时建议在混合物上面铺一层石蜡油，减少 PCR 过程中尤其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失。研究表明，应用石蜡油可使扩增产量增加 5 倍，可能与石蜡油维持热恒定和整个反应体系中盐浓度有关。  
 
 
 
电泳分析  
　　在实际工作中常采用琼脂糖凝胶电泳。一般情况下先在电泳缓冲液或凝胶中加 1% 溴化乙锭（ EB ）（每 100ml 加 100 μ l ），然后将已经制备好的 1% ～ 2% 琼脂糖凝胶（用电泳缓冲液配制）放入电泳槽内，加入待测样品 10 μ l ，同时用分子量标准品作标记。琼脂糖浓度应按分离 DNA 片段的大小进行选择，一般用 1.5% ～ 2% ，电泳电压 75V ，待样品进行凝胶内距胶末端 1cm 时，切断电源，取出凝胶在紫外灯下直接观察结果。  
　　由于溴化乙锭可与双链  
 
DNA 形成结合物，在紫外灯下能发射荧光，使 EB 的荧光强度增强 80 ～ 100 倍，所以，电泳后凝胶在紫外灯下可直接观察。一般肉眼观察 DNA 量可达 10ng ，其荧光强度与 DNA 含量成正比。  
DNA 分子在凝胶中泳动速度决定于电荷效应及分子效应。前者由所带净电荷量决定，而后者与分子大小及构型有关。按照 DNA 分子大小，其凝胶浓度可做不同的调整。有条件的实验室也可用聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）分析扩增的 DNA 片段。  

表 22-2 电泳检测扩增结果， EB 荧光显色（ 254nm ）