细胞凋亡检测操作流程3

凋亡检测操作流程

三、JC-1检测凋亡细胞线粒体膜电位改变


BD™ MitoScreen (JC-1)线粒体膜电位检测试剂盒（551302）： 

组分 描述
JC-1(染料) 4瓶，每瓶用于25个样本。冻干粉，使用前稀释至储存液（Stock Solution），使用时稀释至工作液（Working Solution）
10 x Assay Buffer 60ml，足以用于100个样本。使用前稀释至1X

试剂准备： 

A.10× Assay Buffer的稀释（Assay Buffer作为实验的反应液用于清洗细胞） ： 
    a) 使用前将10× Assay Buffer置于37°C水浴箱中至溶解。
    b) 用双蒸水1：10稀释10× Assay Buffer，搅拌5分钟。
    c) 使用前将1× Assay Buffer 在37°C预热。

JC-1储存液的配制（一瓶）： 

    a) 室温下每瓶用125μl DMSO 稀释JC-1冻干粉。反复倒置混匀小瓶使JC-1充分溶解。 
    b) 储存液应立即稀释为工作液或分装成小份（避光操作），-20°C保存（可长达6个月）。
    c) 避免反复冻融JC-1储存液。 


JC-1工作液的配制：
      a) 37°C预热1× Assay Buffer。
      b) 用1× Assay Buffer 1：100稀释 JC-1储存液至JC-1工作液。例如将125μl的JC-1储存液加入 12.375ml 预热的1× Assay Buffer中。 实验操作时，每个样本（<106细胞）需要0.5ml的JC-1工 作液。
      c) 轻柔混匀JC-1工作液待用。（混匀后可能会出现少许JC-1聚集微粒，但并不影响流式检测。也可在室温13,000g离心3分钟或 1，000g 离心15分钟去除JC-1团絮。）

  实验操作：

制备1x106 /ml的细胞悬液， 浓度不宜过高，因为超过该浓度容易造成细胞的凋亡。
诱导细胞进行凋亡的处理，同时保留一份未经诱导的细胞作为对照。
凋亡处理结束后，每个无菌的15ml聚苯乙烯离心管中加入1ml细胞悬液，室温下，400×g ，离心5分 钟，弃上清。 
每管加入0.5 ml 新鲜配制的JC-1工作液，充分混匀后置于37°C的CO2培养箱，孵育10-15分钟。
按以下步骤洗涤细胞两次：
  *次：每管加体积为2 ml的 1× Assay Buffer，轻轻悬浮细胞，振荡或用枪头使细胞分散，以免细 胞聚集成块。400×g ，室温离心5分钟，弃上清。 
  第二次：每管加体积为1ml的 1× Assay Buffer，轻轻悬浮细胞，振荡或用枪头使细胞分散，以免细 胞聚集成块。400×g ，室温离心5分钟，弃上清。 
每管加体积为0.5 ml的 1× Assay Buffer，轻轻悬浮细胞，上机检测。