一、产品及特点：
本试剂盒提供合成cDNA*链所需要的全部试剂。其原理是用突变的莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶（M-MuLV RT）合成mRNA的全长cDNA拷贝。
1.使用突变的反转录酶，内源RNase H活性低。
2.zui长可合成13 Kb的cDNA。
3.可以使用oligo-dT、随机引物和RNA专一性引物三种引物（前两种本试剂盒提供）。
4.总RNA、poly(A)+RNA或特殊RNA均可作为模板。
5.可用于cDNA文库构建、RT-PCR、探针标记等。
规格及成分 成 份 编号 10次包装 50次包装
MMLV（含RI） 60906A 20 uL 100 uL
RT Buffer（含dNTP） 60906B 60 uL 300 uL
Oligo (dT)18引物(0.5 ug/uL) 100814 10 uL 50 uL
Random Primer(0.2 ug/uL) 100409 10 uL 50 uL
RNase-free水 80403 1 mL 1 mL
使用手册 1份 1份
运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年。
二、使用方法
合成PCR用的1st-strand cDNA
1.按下表配制RT反应体系:
RNA模板
总RNA 100-500 ng
或poly(A) mRNA 10-500 ng
或专一的RNA 0.01 pg-500 ng
注意：RNA样品不能含有基因组DNA污染。
引物
Oligo (dT)18(0.5 ug/uL) 1 uL
或随机引物(0.2 ug/uL) 1 uL
或RNA模板专一性引物 15-20 pmol
注意：随机引物与RNA模板的比例跟cDNA合成的平均长度成反比。
RNase-free水 补水到13 uL
2.70℃保温5分钟后立即冰浴。
3.再加入5 uL RT Buffer（含dNTP）。
4.37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GC RNA 模板，可以改成45℃保温5分钟。如果使用随机引物，则改成25℃ 5分钟。
5.加入2 uL MMLV逆转录酶（含RI），反应终体积为20 uL。
6.42℃保温60分钟（但如果使用随机引物，需要先25℃保温10分钟，然后再转移到42℃保温60分钟）。此步为RT反应。
7.70℃保温10分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作为PCR模板使用，不需要纯化。
合成建文库用的1st-strand cDNA
1.按下表配制RT反应体系:
RNA模板
poly(A) mRNA 1 ug
或专一的RNA 0.5-1 ug
注意：RNA样品不能含有基因组DNA污染。
引物
Oligo (dT)18(0.5 ug/uL) 1 uL
或随机引物(0.2 ug/uL) 1 uL
或RNA模板专一性引物 100 pmol
注意：随机引物于RNA模板的比例跟cDNA合成的平均长度成反比。
RNase-free水 补水到13 uL
2.70℃保温5分钟后立即冰浴。
3.再加入5 uL RT Buffer（含dNTP）。
4.37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GC RNA 模板，可以改成45℃保温5分钟。如果使用随机引物，则改成25℃ 5分钟）。
5.加入2 uL MMLV逆转录酶（含RI），反应终体积为20uL。
6.42℃保温60分钟（但如果使用随机引物，需要先25℃保温10分钟，然后再转移到42℃保温60分钟）。此步为RT反应。
7.70℃保温10分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的cDNA可以用于第二链cDNA的合成或放置在-20℃*保存。
三：用对照模板合成cDNA(需要用同位素，需要对照的客户需要单独跟天泽基因)
1.按下表配制RT反应体系:
对照RNA模板(0.5 ug/uL) 2 uL
引物
Oligo (dT)18(0.5 ug/uL) 1 uL
或随机引物(0.2 ug/uL) 1 uL
或对照引物 2 uL
RNase-free水 补水到13 uL
2.70℃保温5分钟后立即冰浴。
3.再加入5 uL RT Buffer（含标记dNTP，本试剂不提供）。
4.37℃保温5分钟。如果使用随机引物，则保温温度只能是25℃。
5.加入2 uL MMLV逆转录酶（含RI），反应终体积为20uL。
6.42℃保温60分钟（但如果使用随机引物，需要先25℃保温10分钟，然后再转移到42℃保温60分钟）。
7.加1uL 0.5M EDTA，放置在冰上待用。
8.电泳检测。合成的cDNA的量一般有加入RNA总量的50%以上，电泳一般能出现1.1Kb的片段（如果使用随机引物，将出现多个小片段）。
