适用
适用于检测水样中有机磷酸盐和有机磷酸酯（硫代磷酸盐[酯] 杀虫剂、氨基甲酸酯(类) 杀虫剂）。检测其它样品时需要我公司取得相关前处理的资料。
原理
这是一个定性的有机磷酸盐和有机磷酸酯的检测方法。对乙酰*酯酶的抑制剂进行了修饰。乙酰*酯酶（ACh-E）水解acetylthiocholine (ATC)，然而ATC可以与5,5’-Dithio-bis(2-Nitrobenzoic Acid) [DTNB]反应
生成黄色可以在405 nm下读取吸光度值。如果样品中还有有机磷酸盐和有机磷酸酯，那么它们将抑制ACh-E的活性，影响颜色反应的发生。有机磷酸盐和有机磷酸酯检测限与他们对酶活性的抑制能力有关。
如果能证实样品中仅含有机磷酸盐和有机磷酸酯，这个测定和合适的标准联用可以进行定量检测。
试剂盒组成
1 | 1块酶标板 8条 X 12孔 |
2 | 1瓶l (蓝盖t), 用于稀释 thesubstate (ATC), 5 ml. |
3 | 1 瓶 (绿盖), 用于稀释 lyophilized ACh-E, 3 ml. |
4 | 1 黄色瓶 1 ml 阳性杀虫剂对照 5 ppb Diazinon（二嗪农,地亚农,敌匹硫磷） 溶解于50% MEOH |
5 | 1 黄色瓶 (橙黄色荧光盖), 1 ml of OXIDIZER（氧化剂） . |
6 | 检测缓冲液和氧化剂稀释液(橙黄色荧光盖), 10 ml. |
7 | 1 瓶 (红盖), 3 ml.-NEUTRALIZER（中和剂） |
8 | 1 瓶 (绿盖) ACh-E, lyophilized（低压冻干） |
9 | 1 瓶 (绿盖), SUBSTRATE（酶作用底物）, ATC, lyophilized（低压冻干） |
10 | 1 瓶 (黄色荧光盖), CHROMOGEN(DTNB) 色原体3 ml. |
11 | 1 瓶 (紫盖),STOPPING SOLUTION（终止液）, 3 ml. |
12 | 1黄色瓶 1ml 阴性杀虫剂对照溶解于50% MEOH. |
保存和稳定性
储存在 2-8°C. 在有效期内都可以使用。试剂盒用完后的垃圾要按照当地政府的政策法规处理。
需要但不提供的试剂
25-1000 ul 的移液器和吸头
405-450 nm 酶标仪
用于氧化剂稀释的试管和管形瓶
样品信息
1.水样：
- 把水样溶于等体积 MEOH中（例如：1ml水样+ 1mlMEOH）。除水样外请我公司索取前处理方法。
- 来自废水表面的不溶残留物或浓缩后的干物质也可以处理。
- 包含粗物质的水样需要过滤(e.g. 0.2 um Anotop™ 25 Plus, Whatman, Inc.)。色素物质或涂料对检测结果有影响，因此要用类似的物质做一个阴性对照。
2.蔬菜/水果：
- 称量10克搅碎样品于一个50mL的离心管里，加入20mL分析纯甲醇，涡旋混匀1min，室温（22.5±2.5）°C下转速4000rpm离心3min;
- 过滤转移一定体积上清液到干净烧杯里，取1mL过滤液于一试管里，加入1mL蒸馏水稀释；
- 涡旋混匀1min，可得待检样品液；
注：（若样品OD/阴性质控OD x* ＞ 20%为阴性，MRL为10ppb）
3.酒样：
- 取5mL酒样于一离心管内，加入0.2gNaCl,2mL正己烷，进行涡旋振荡3min进行萃取，静置5min，转移上层液至另一装有0.4g无水NaSO4的离心管里，再重复一遍以上萃取步骤，合并全部有机相。
- 4000rpm转速离心5min，转移上层正己烷至干净的试管中氮吹吹干，用1mL50%甲醇复溶干燥物，
- 复溶液过0.2um有机相滤膜，可得待检样品液；
注：（若样品OD/阴性质控OD x* ＞ 20%为阴性，MRL为0.5ppb）
试剂准备
在使用试剂盒时所有试剂都要回复到室温。
1）ACh-E –加3ml ACh-E diluent（稀释液）到冻干的 ACh-E 中，盖紧盖适当的震荡，在检测前至少要溶解5min。
2）Oxidizer（氧化剂）–根据所测样品的数量配制氧化剂。稀释氧化剂（1份氧化剂+ 9份氧化剂稀释液）。适当的震荡，每次检测前配制必须是新鲜的。
3）Substrate (ATC) （酶作用底物）– 加3ml ATC 稀释液到冻干的ATC 中，盖紧盖适当的震荡。
注意事项
操作要规范，在加完每种试剂后要混合均匀。注意在震荡时不要把微孔中的液体溢出去（震荡时可以用手拿着微孔板在桌面上做圆周运动。在加液时避免吸头和反应液直接接触要把液体直接加到微孔板的底部。
确保每个微孔中加的液体的量一致。避免试剂的交叉污染和携带污染，添加每个样品都要用干净的吸头。加液时吸头不要和微孔壁上的液体接触。如果在户外操作要避免阳光直射。不要使用过期试剂。避免皮肤和粘膜与试剂接触。如果试剂与皮肤接触请用大量的水冲洗。
局限性
这个Abraxis OP/Carbamate 检测方法对不同的有机磷酸盐和氨基甲酸酯(类)的检测特异性不同。请参考后面的特异性表。如果需要可以通过其它传统的方法如GC, HPLC,验证。
对照
阳性对照：浓度为5 ppb Diazinon（二嗪农,地亚农,敌匹硫磷）。在每次检测时都要做。
检测步骤
在做检测之前要认真阅读试剂配制方法和注意事项
- 在检测用的酶标板中加入50ul检测缓冲液（橙黄色荧光盖）。
- 在的检测孔中加入25ul 适当的对照或样品。震荡酶标板15秒
3、在每个微孔中加入25ul 稀释的氧化剂（diluted Oxidizer），震荡酶标板15秒，室温孵育5min。
4、在每个微孔中加入25ul Neutralize 中和剂（红盖），震荡酶标板15秒。
5、在每个微孔中加入25ul ACh-E（绿盖），震荡酶标板15秒，室温孵育15min。
6、在每个微孔中加入25ul Substrate-ATC（蓝盖），震荡酶标板15秒。
7、在每个微孔中加入25ul Chromogen – DTNB（黄色荧光盖），震荡酶标板15秒，室温孵育15min。
8、在每个微孔中加入25ul终止液，震荡酶标板15秒，在405nm 或450nm下读数，要确保微孔中没有气泡。
结果分析
阴性对照和没有检测到有机磷酸盐和氨基甲酸酯的样品将呈现深黄色。含有有机磷酸盐和氨基甲酸酯的样品与阴性对照相比将呈现比较浅的颜色。20%的颜色抑制作用指示了有机磷酸盐和氨基甲酸酯的检测限或高于检测限。
注意：如果阴性对照不能产生黄色说明这次检测无效需要重新检测。
敏感性
精密度
