一、实验方法 

1. 膀胱平滑肌细胞酶法分离

（1）肌注盐酸200 mg 及*5 mg 麻醉，待兔进入麻醉状态后消毒，下腹正中切口，迅速切取膀胱组织。

（2）超净台内依次*溶液(浓度为100 单位/毫升)、生理盐水及D-Hanks’液中浸泡洗涤 5 分钟，然后放入D-Hanks液中除去黏膜、黏膜下及浆膜层。

（3）肌肉剪成肉糜后0.1%Ⅱ型胶原酶(2 mg/mL) 溶液 40 过夜消化(约10-12 小时)。

（4）然后加 0.25%* 370 消化30 分钟，消化液变混浊呈絮状提示消化良好。

（5）用100 目细胞筛过滤该絮状液，混悬液离心(1000  转/分，离心半径 13 cm) 5 分钟，沉淀的细胞移入培养皿，加入含 10%胎牛血清的DMEM，置于50 mL/L CO₂、37℃饱和湿度孵育箱中静置培养， 培养液每周更换 2-3 次。

2. 传代培养

（1）待培养的细胞通过增殖达到约 80%汇合状态时做传代处理。

（2）弃去原培养瓶中的旧培养液，加入适量 的PBS(因培养液中的胎牛血清对*有抑制作用)，轻轻摇动，清洗残留的培养液后弃之。

（3）加入适量的消化液，使其覆盖整个细胞，将培养瓶放置于CO₂培养箱，不时在倒置显微镜下观察，当细胞胞质回 缩，胞间间隙增大后，吸出消化液，并向培养瓶中加入含10%胎牛血清的培养液终止消化。

（4）用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁制备细胞悬液，吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。

（5）细胞进行计数后，按照 1X10⁵~10⁶细胞/mL 密度将细胞接种于培养瓶中。

3. 培养细胞的观察及鉴定

采用倒置显微镜观察平滑肌细胞的形态及生长情况。细胞爬片HE 染色观察细胞形态，电镜检查，免疫组化染色检测α-SMA。

二、结果 

两只兔所有标本均获成功。倒置显微镜观察平滑肌细胞24 小时均可见膀胱平滑肌细胞贴壁生长，正常兔 7 天左右、而梗阻兔则需10~12 天可于50 毫升培养瓶约 80%汇合。

均传代顺利，传代后约正常兔6天左右、而梗阻兔需8~9 天可于50 毫升培养瓶约 80%汇合。

本组中均传至第8 代，经第8 次传代后， 平滑肌细胞仍生长迅速，未见衰老迹象。

倒置显微镜下观察均呈“谷和峰”样结构(图1 中对照组2 周的 细胞；图2 中实验组培养2 周的细胞)。

细胞爬片HE染色见膀胱平滑肌细胞细胞核呈两端钝圆的卵圆形平滑肌细胞核型(见图 3)。

电镜检查可见平滑肌细胞密班结构(图 4)。

免疫组化染色检测α-SMA 呈阳性反应(图 5)。

从细胞爬片HE染色和免疫组化染色检测α-SMA 呈阳性反应中我们发现该方法所的膀胱平滑肌细胞的纯度几乎99%。