targetingsystems（targeting systems）DLAR-4

targetingsystems(targeting systems)DLAR-4

Cypridina-Renilla 荧光素酶的双重检测

描述：

基于单一溶液的双荧光素酶检测试剂：

节省筛选应用的成本和时间

已开发出一组改进的超灵敏分泌型荧光素酶报告基因，以分析同一组转染细胞中的两种不同启动子活性。这种方法还使人们能够在不杀死细胞的情况下实时研究反应，因为这三个报告基因是分泌的。Targeting Systems 提供了许多不同的细胞内和分泌型双荧光素酶检测试剂。Cycpridina -Gaussia 萤光素酶检测系统特别有吸引力，因为 Cypridina 萤光素酶和 Gaussia 萤光素酶在细胞内和分泌部分都具有强大的活性，并且在使用该试剂进行检测时都具有稳定的生物发光信号。Renilla 荧光素酶生物发光信号的稳定性（图 2）。

Cypridina (Vargula) 萤光素酶：来自海洋介形鱼 Vargula Hilgendorfi 的 Cypridina 萤光素酶（以前称为 Vargula 萤光素酶）是一种分泌型萤光素酶，最大发射波长为 460 nm。它是已知的最亮的荧光素酶之一，具有最高的转化率。

高斯荧光素酶：Gaussia Luciferase 是一种来自海洋桡足类 Gaussia Princeps (1,2) 的荧光素酶。这种不需要 ATP 的荧光素酶在产生光的反应中催化底物腔肠素的氧化，并且与其他发光报告基因相比具有相当大的优势，例如可分泌性和更亮的信号强度，以及出色的生物发光信号稳定性。大约 10% 在一小时内衰减。从用表达 GLuc 的质粒转染的培养细胞的上清液中测得的发光与产生的酶量成正比，这反过来又反映了转录水平。或者，细胞裂解物可用于尽管大部分活性是分泌的，但 Gaussia 荧光素酶的高灵敏度也允许从细胞裂解物中进行测量。

生物发光信号和发射光谱的稳定性

图A



图B

DLAR-4 targetingsystems  

图2： 使用荧光素酶测定试剂在DLAR-4系统中的不同荧光素酶报告荧光素酶活性的动力学：建立反应以测量转染细胞样品中不同荧光素酶的荧光素酶活性的动力学。使用 DLAR-4 荧光素酶测定试剂测定荧光素酶活性。图 A：使用 DLAR-4 双检测系统的 VLAR 组件时 Cypridina 荧光素酶生物发光信号的稳定性。图 B：使用 GAR-2 试剂和稳定剂时 GLuc 生物发光信号的稳定性。该试剂适用于需要检测大量样品的 HTS 应用。在没有稳定剂的情况下，信号强度最初略高，但比有稳定剂时衰减得更快。注意：显示的数据是在 Turner TD2020 光度计上测量的三次重复测定的平均值。

好处：

Cypridina Luciferase 和 Gaussia luciferas 在转染细胞的上清液和裂解物中都具有非常强的信号。因此可用作双分泌型报告基因或双胞内报告基因。

天然 Cypridina (Vargula) 荧光素酶和 Gaussia 荧光素酶具有天然分泌信号，并且在表达后有效分泌到细胞培养基中。检测荧光素酶不需要细胞裂解

Cypridinaia 萤光素酶是已知最亮的萤光素酶之一，与常用的萤火虫萤光素酶相比，它具有最高的转换数和更高的生物发光信号强度，使其成为理想的转录报告基因 (1)。

Gaussia 萤光素酶检测系统的稳定剂成分在更长的时间内提供稳定的动力学，让用户有时间进行高通量分析以及手动交付的检测。

分泌的 Cypridina luciferas 蛋白是稳定的，并且在产光方面具有*的活性，因此可以进行非常灵敏的检测 (1,2)。

含有 VLuc 和分泌型海肾荧光素酶（即转染后的生长培养基或细胞裂解物）的样品可以在 -20°C 下长期保存。

Cypridina-Gaussia Luciferase Dual Assay Reagent-DLAR-4

套件内容：

100x 腔肠素

储存于 -20°C

Gaussia 荧光素酶测定稀释缓冲液 - 4°C 保存

Gaussia 荧光素酶测定 (GAR) 稳定剂 - 4°C 保存

100x Cypridina Luciferin 底物 -储存于 -80°C

Cypridina 底物稀释缓冲液 - 4°C 保存

VLAR 缓冲液（Cypridina 荧光素酶检测缓冲液）- 4°C 保存

Cypridina (Vargula) 荧光素酶检测缓冲液 - 4°C 保存

协议：

细胞上清液检测：

Gaussia 萤光素酶检测

用所需量的 Gaussia 荧光素酶测定稀释缓冲液将 100X 腔肠素稀释至 1X（每次测定需要 50 ul 稀释试剂）。

将 5-20 µl 含有 Gaussia 荧光素酶或 Cypridina 荧光素酶的样品移入每个孔或光度计管中进行检测

向每个样品中添加 8 ul GAR 稳定剂（这是可选的，如果省略稳定剂，则会获得更高但不太稳定的信号。

向每个样品中加入 50 ul Gaussia 荧光素酶检测试剂（按步骤 1 所述制备）。混合均匀并在光度计中读取。

Cypridina (Vargula) 荧光素酶测定

用 Cypridina (Vargula) 底物稀释缓冲液将 10 µl Vargulin 底物稀释至 1 ml。

将 5-20 µl 含有 Gaussia 荧光素酶或 Cypridina 荧光素酶的样品移入每个孔或光度计管中进行检测

向每个样品中加入 40 ul VLAR 检测缓冲液。

将 20 ul 稀释的 Cypridina 荧光素底物（Vargulin）按步骤 1 中所述制备，添加到每个样品中。混合均匀并在光度计中读取。

细胞裂解物中萤光素酶活性的测定： GAR 或 VLAR 萤光素酶测定试剂也可用于测量预裂解细胞中的萤光素酶活性。注意：如果您需要测量细胞内荧光素酶活性，请先使用 Targeting Systems 的细胞裂解缓冲液裂解细胞。（目录号 5X CLR-01）

用水稀释 5X CLR 缓冲液 1:5。

吸出细胞培养基并用无血清 DMEM 洗涤细胞两次。

添加足够的 1X 细胞裂解缓冲液以覆盖细胞。添加足够的裂解缓冲液以覆盖 cell.s（96 孔为 50 ul，12 孔为 300 ul，6 孔培养皿为 800 ul，10 cm 培养皿为 3 ml

在定轨振荡器（室温）上以 400 rpm 的速度摇动 20 分钟。

将 5-20 µl 含有荧光素酶的样品或细胞裂解物与 100 µl 荧光素酶检测试剂盒 (TS-1) 混合，并立即在光度计中读数。

所有测定试剂在测定时应接近室温。

参考：

Yamagishi, K.、Enomoto, T. 和 Ohmiya, Y. (2006) Anal。生物化学，354，15-21。

Wu, C.、Suzuki-Ogoh, C. 和 Ohmiya, Y. (2007) Biotechniques, 42, 290-292。

Elisa Michelini、Luca Cevenini、Laura Mezzanotte、Danielle Ablamsky、Tara Southworth、Bruce Branchini 和 Aldo Roda* (2007) 用于多重生物发光和高内涵筛选的光谱解析基因技术。肛闷。化学，10.1021/ac7016579 S0003-2700(70)01657-8

4) BR Branchini、TL Southworth、JP DeAngelis、A Roda 和 E Michelini (2006) 来自意大利萤火虫 Luciola italica 的荧光素酶：分子克隆和表达。Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2006 年 10 月；145（2）：159-67。

4) BR Branchini、DM Ablamsky、MH Murtiashaw、L Uzasci、H Fraga 和 TL Southworth (2007) 用于生物发光报告基因应用的耐热红光和绿光萤火虫荧光素酶突变体。肛闷生物化学，2007 年 2 月：361(2)：253-62。