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上海禾工科学仪器有限公司
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阅读：1356发布时间：2009-11-19
提要 采用液相色谱法对低分子量*（LMWH）分子量及其分布进行了测定。流动相选用2.84%的硫酸钠溶液，采用紫外检测器与示差折光检测器串联连接，紫外检测波长234 nm，色谱柱为Protein-Pak Φ8 mm×300 mm。结果表明：所测三批LMWH的重均分子量分别为3 158 D,4 387D,4 226D；其中分子量小于8 000D的量分别为86.2%，89.4%，87.8%，符合英国药典1993年增补版标准。
低分子量*是商品*经化学解聚而得的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，临床上主要用于术后深静脉血栓、不稳定性心绞痛及血液透析等。近年来，国内外对低分子量肝素的剂型及临床应用报道较多，但以HPLC法测定其分子量报道较少，现采用HPLC法对LMWH分子量及其分布进行测定。
1 实验部分
1.1 仪器、药品及试剂
液相色谱仪（Waters公司）。低分子量肝素标准品（HO190 000，进口，Mna为3 700）；供试品三批（色谱自制）；所用试剂均为色谱纯。
1.2 方法［1］与结果
以Protein-Pak Φ8 mm×300mm为色谱柱，选用2.84%（w/v）硫酸钠作流动相，柱温40℃，示差折光检测器进口与UV检测器出口相连，紫外检测波长为234nm。
精密称取低分子量肝素标准品及供试品，按10 mg/ml的比例加流动相溶解；用流动相配制0.01mol/L的NaN3溶液。按以上条件进样，进样量10μl，用NaN3测得紫外检测器与示差折光检测器出峰时间有一定的间隔，其间隔时间为15 s．
根据标准品在RI曲线及UV234曲线下的面积计算r,r=ΣRI/ΣUV234［2］；图谱上任一点的分子量Mi=Mna RIi/rUV234i（Mna为低分子量肝素标准品的数均分子量3700，RIi为此点的RI面积，UV234i为此点的UV234面积），则供试品的重均分子量Mw＝Σ（RIiMi）/ΣRIi。分子量分布按RI色谱图下小于8 000D的RI面积占RI总面积的百分数，结果见表1。
Table 1 The molecular weight and its distribution results ofLMWH
Batch NO. mw Molecular wieght distribution
9707 3158D 86.2%
9702 4387D 89.4%
9703 4226D 87.8%
2 讨论
低分子量肝素的生物活性与其分子量及分子量分布密切相关，随着分子量的降低，其抗FⅡa活性下降，因此低分子量肝素的分子量及分布是产品质量控制的关键指标。以往曾采用粘度法测定LMWH的分子量［3］，但此法不能考察其分子量的分布情况，实验采用HPLC方法，快速准确地测定了LMWH的分子量及其分布。
由于示差折光检测器与紫外检测器串联连接，因此由其产生的色谱图之间有时间间隔，通过NaN3可准确测定二者的时间差，使所测数值更准确。另外，通过RI图谱发现，盐峰、溶剂峰与主峰保留时间较接近，如何使其影响更小是今后有待解决的问题。
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