Mouse Insulin （INS）ELISA Kit
 
 
 
Catalog No. CSB-E05071m
（96T）
 
 
 
 
 
 
  This immunoassay kit allows for the in vitro quantitative determination of mouse INS
concentrations in serum, plasma and other biological fluids.
  Expiration date      six months from the date of manufacture
  FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.
 
 
 
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INTRODUCTION
Insulin is a peptide hormone composed of 51 amino acid residues and has a
molecular weight of 5808 Da. It is produced in the islets of Langerhans in the
pancreas. Insulin's structure varies slightly between species of animal. Insulin
has extensive effects on both metabolism and several other body systems （eg,
vascular  compliance）.  Insulin  causes  most  of  the  body's  cells  to  take  up
glucose from the blood （including liver, muscle, and fat tissue cells）, storing it
as glycogen in the liver and muscle, and stops use of fat as an energy source.
When insulin is absent （or low）, glucose is not taken up by most body cells and
the  body  begins  to  use  fat  as  an  energy  source  （ie,  transfer  of  lipids  from
adipose tissue to the liver for mobilization as an energy source）. As its level is
a  central metabolic  control mechanism,  its  status  is  also  used  as  a  control
signal to other body systems （such as amino acid uptake by body cells）. It has
several other anabolic effects throughout the body.
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The microtiter plate provided in this kit has been pre-coated with an antibody
specific  to  INS.  Standards  or  samples  are  then  added  to  the  appropriate
microtiter  plate  wells  with  a  Horseradish  Peroxidase  （HRP）-conjugated 
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monoclonal  antibody  preparation  specific  for  INS  and  incubated.  Then
substrate  solution  A  and  B  are  added  to  each  well.  Only  those  wells  that
contain  INS,  HRP-conjugated  antibody  will  exhibit  a  change  in  color.  The
enzyme-substrate  reaction  is  terminated  by  the  addition  of  a  sulphuric  acid
solution  and  the  color  change  is  measured  spectrophotometrically  at  a
wavelength of 450 nm ± 2 nm. The concentration of INS in the samples is then
determined by comparing the O.D. of the samples to the standard curve.
DETECTION RANGE
8µIU/ml-140µIU/ml. The standard curve concentrations used  for  the ELISA’s
were 140µIU/ml,80µIU/ml,32µIU/ml, 16µIU/ml, 8µIU/ml
SPECIFICITY
This  assay  recognizes  recombinant  and  natural mouse  INS.  No  significant
cross-reactivity or interference was observed.
SENSITIVITY
The minimum detectable dose of mouse INS is typically less than 5µIU/ml.
The sensitivity of this assay, or Lower Limit of Detection （LLD） was defined as
the lowest concentration that could be differentiated from zero. 
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MATERIALS PROVIDED
Reagent      Quantity
Assay plate  1
Standard（S1-S5）  5
HRP-conjugate    1 x 6 ml
Wash Buffer      
1 x 15 ml
  （20×concentrate）
Substrate A  1 x 7 ml
Substrate B  1 x 7 ml
Stop Solution      1 x 7 ml
Standard
Standard
1
Standard
2
Standard
3
Standard
4
Standard
5
Concentration
（µIU/ml）
8  16  32  80  140
STORAGE
1.  Unopened  test  kits  should  be  stored  at  2-8°C  upon  receipt  and  the
microtiter  plate  should  be  kept  in  a  sealed  bag  to minimize  exposure  to
damp air. The test kit may be used throughout the expiration date of the kit.
Refer to the package label for the expiration date.
2.  Opened test kits will remain stable until the expiring date shown, provided it
is stored as prescribed above.     
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3.  A microtiter plate reader with a bandwidth of 10 nm or less and an optical
density range of 0-3 OD or greater at 450nm wavelength is acceptable for
use in absorbance measurement.
REAGENT PREPARATION
1.  Bring all  reagents and plate  to  room  temperature  for at  least 30 minutes
before use. Unused wells need store at 2-8°C and av oid sunlight.
2.  Wash Buffer  If  crystals  have  formed  in  the  concentrate, warm  to  room
temperature and mix gently until  the  crystals have  compley dissolved.
Dilute 15 ml of Wash Buffer Concentrate into deionized or distilled water to
prepare 300 ml of Wash Buffer.
Precaution: The Stop Solution provided with this kit is an acid solution. Wear eye,
hand, face, and clothing protection when using this material.
OTHER SUPPLIES REQUIRED
  Microplate  reader capable of measuring absorbance at 450 nm, with  the
correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.
  Pipettes and pipette tips.
  Deionized or distilled water.
  Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer. 
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SAMPLE COLLECTION AND STORAGE
  Serum    Use a serum separator tube （SST） and allow samples to clot for
30 minutes before centrifugation for 15 minutes at 1000 g. Remove serum
and  assay  immediay  or  aliquot  and  store  samples  at  -20°  C.  Avoid
repeated freeze-thaw cycles.
  Plasma    Collect  plasma  using  citrate,  EDTA,  or  heparin  as  an
anticoagulant. Centrifuge  for 15 minutes at 1000 g within 30 minutes of
collection. Assay immediay or aliquot and store samples at -20°C. Avoid
repeated freeze-thaw cycles.
Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay.
ASSAY PROCEDURE
Bring all reagents and samples to room temperature before use. It is recommended
that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.
1.  Set a Blank well without any solution. Add 50µl of Standard or Sample per
well. Standard need test in duplicate.  
2.  Reconstitute the every Standard with 0.5 ml of distilled water.
3.  Add 50µl of HRP-conjugate to each well （not to Blank well）. Mix well and
then incubate for 2 hour at 37°C.   
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4.  Complete remove  the liquid. Then fill each well with Wash Buffer （about
200µl）, stay for 10 seconds and Spinning. Repeat the process for a total of
three washes. Complete removal of liquid at each step is essential to good
performance. After  the  last wash, remove any remaining Wash Buffer by
aspirating  or  decanting.  Invert  the  plate  and  blot  it  against  clean  paper
towels.
5.  Add 50µl of Substrate A and 50µl of Substrate B to each well, mix well.
Incubate for 15 minutes at 37°C. Keeping the plate  away from drafts and
other temperature fluctuations in the dark.
6.  Add 50µl of Stop Solution to each well. If color change does not appear
uniform, gently tap the plate to ensure thorough mixing.
7.  Determine  the  optical  density  of  each  well  within  10  minutes,  using  a
microplate reader set to 450 nm.
CALCULATION OF RESULTS
Average  the  duplicate  readings  for  each  standard,  control,  and  sample  and
subtract the average zero standard optical density. Create a standard curve by
reducing  the  data  using  computer  software  capable  of  generating  a  four
parameter  logistic  （4-PL）  curve-fit.  As  an  alternative,  construct  a  standard
curve by plotting the mean absorbance for each standard on the y-axis against 
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the concentration on the x-axis and draw a best fit curve through the points on
the  graph.  The  data  may  be  linearized  by  plotting  the  log  of  the  INS
concentrations  versus  the  log  of  the  O.D.  and  the  best  fit  line  can  be
determined by regression analysis. This procedure will produce an adequate
but less precise fit of the data. If samples have been diluted, the concentration
read from the standard curve must be multiplied by the dilution factor.
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
  The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.
  Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.
  It is important that the Calibrator Diluent selected for the standard curve be
consistent with the samples being assayed.
  If  samples  generate  values  higher  than  the  highest  standard,  dilute  the
samples with the appropriate Calibrator Diluent and repeat the assay.
  Any variation  in Standard Diluent, operator, pipetting  technique, washing
technique, incubation time or temperature, and kit age can cause variation
in binding.
  This  assay  is  designed  to  eliminate  interference  by  soluble  receptors,
binding proteins, and other factors present  in biological samples. Until all
factors have been tested in the Quantikine Immunoassay, the possibility of
interference cannot be excluded. 
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TECHNICAL HINTS
  When mixing or reconstituting protein solutions, always avoid foaming.
  To  avoid  cross-contamination,  change  pipette  tips  between  additions  of
each  standard  level,  between  sample  additions,  and  between  reagent
additions. Also, use separate reservoirs for each reagent.
  When using an automated plate washer, adding a 30 second soak period
following the addition of wash buffer, and/or rotating the plate 180 degrees
between wash steps may improve assay precision.
  To  ensure  accurate  results,  proper  adhesion  of  plate  sealers  during
incubation steps is necessary.
  Substrate Solution should remain colorless until added to the plate. Keep
Substrate Solution protected from light. Substrate Solution should change
from colorless to gradations of blue.
  Stop  Solution  should  be  added  to  the  plate  in  the  same  order  as  the
Substrate Solution. The color developed in the wells will turn from blue to
yellow  upon addition of  the Stop Solution. Wells  that are  green  in  color
indicate that the Stop Solution has not mixed thoroughly with the Substrate
Solution.
 
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小 小小 小鼠 鼠鼠 鼠胰岛素 胰岛素 胰岛素 胰岛素（ （（ （Insulin） ）） ）ELISA快速检测试剂盒 快速检测试剂盒 快速检测试剂盒 快速检测试剂盒
使用说明书 使用说明书 使用说明书 使用说明书
本试剂盒仅供研究使用 本试剂盒仅供研究使用 本试剂盒仅供研究使用 本试剂盒仅供研究使用
产品编号 产品编号 产品编号 产品编号：CSB-E05071m
检测范围 检测范围 检测范围 检测范围： ：： ：8µIU /ml -140µIU /ml
特异性 特异性 特异性 特异性： ：： ：本试剂盒可同时检测天然或重组的 INS，且与其他相关蛋白基本无
交叉反应。
有效期 有效期 有效期 有效期：6 个月（2-8℃避光保存）
预期应用 预期应用 预期应用 预期应用： ：： ：ELISA法定量测定小鼠血清，血浆及其它相关生物液体中 INS 含
量。
说明 说明 说明 说明  
1.  浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。  
2.  刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验
结果造成任何影响。
实验原理 实验原理 实验原理 实验原理
采用酶联免疫法夹心法检测胰岛素含量。首先用一株单抗体包被微孔板，
制备成固相抗体，然后加入待测标本及辣根过氧化物酶标记的另一株单抗，使
之形成包被抗体-胰岛素-酶标记抗体的复合物。经显色后在酶标仪测定吸光值
（OD值），通过计算机或作图拟合浓度-吸光度曲线，反算出待测标本中胰岛素
含量。 
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试剂盒组成及试剂配制 试剂盒组成及试剂配制 试剂盒组成及试剂配制 试剂盒组成及试剂配制  
1.  酶联板 酶联板 酶联板 酶联板（Assay plate ）：                                                                    一块 （96孔）。   
2.  标准品 标准品 标准品 标准品 （Standard）：                                                                       5 瓶（冻干品）。 
Standard 1  Standard 2  Standard 3  Standard 4  Standard 5
8µIU/ml  16µIU/ml  32µIU/ml  80µIU/ml  140µIU/ml
3.  酶结合物 酶结合物 酶结合物 酶结合物（ （（ （HRP-conjugate） ）） ）：                                                            1×6ml/瓶。 
4.  显色剂 显色剂 显色剂 显色剂 A（ （（ （Substrate A）： ）： ）： ）：                                                                  1×7ml/瓶。 
5.  显色剂 显色剂 显色剂 显色剂 B（ （（ （Substrate B）： ）： ）： ）：                                                                  1×7ml/瓶。 
6.  浓洗涤液 浓洗涤液 浓洗涤液 浓洗涤液（ （（ （Wash Buffer） ）） ）：       1×15ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释 20 倍。   
7.  终止液 终止液 终止液 终止液（ （（ （Stop Solution） ）） ）：                                                                  1×7ml/瓶
需要而未提供的试剂和器材 需要而未提供的试剂和器材 需要而未提供的试剂和器材 需要而未提供的试剂和器材
1.  标准规格酶标仪
2.  高速离心机
3.  电热恒温培养箱
4.  干净的试管和 Eppendof 管
5.  系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，用多通道移液器
6.  蒸馏水，容量瓶等
标本的 标本的 标本的 标本的采集及保存 采集及保存 采集及保存 采集及保存
1.  血清：全血标本请于室温放置 2 小时或 4℃过夜后于 1000 x g离心 20 分钟，
取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2.  血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000
x g离心 15 分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3.  细胞培养物上清或其它生物标本：1000 x g离心 20 分钟，取上清即可检测，
或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
注 注注 注： ：： ：以上标本置 以上标本置 以上标本置 以上标本置 4℃ ℃℃ ℃保存应小于 保存应小于 保存应小于 保存应小于 1 周 周周 周， ，， ，-20℃ ℃℃ ℃或 或或 或-80℃ ℃℃ ℃均应密 均应密 均应密 均应密封保存 封保存 封保存 封保存， ，， ，-20℃ ℃℃ ℃不应超过 不应超过 不应超过 不应超过 1 个月 个月 个月 个月， ，， ，
-80℃ ℃℃ ℃不应超过 不应超过 不应超过 不应超过 2 个月 个月 个月 个月； ；； ；标本溶血会影响zui后检测结果 标本溶血会影响zui后检测结果 标本溶血会影响zui后检测结果 标本溶血会影响zui后检测结果， ，， ，因此溶血标本不宜进行此项检测 因此溶血标本不宜进行此项检测 因此溶血标本不宜进行此项检测 因此溶血标本不宜进行此项检测。 。。 。 
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操作步骤 操作步骤 操作步骤 操作步骤
1.  将各种试剂至室温〔18-25℃〕平衡半小时，取浓缩洗涤液，根据当批检测
数量，用蒸馏水上 1：20 稀释，混匀后备用。
2.  标准品 S1- S 5，*次使用前先用 0.5ml蒸馏水溶解，放置混匀后使用。
3.  将酶标板取出，设一个空白对照孔、不加任何液体；每个标准点依次各设两
孔，每孔加入相应标准品 50ul；其余每个检测孔直接加待测标本 50ul。  
4.  每孔加入酶结合物 50ul（空白对照孔除外），充分混匀，贴上不干胶封片，
置 37℃温育 2 小时。
5.  手工洗板，弃去孔内液体。洗涤液注满各孔，静置 10 秒甩干，重复三次后
拍干；洗板机洗板，选择洗涤三次程序，洗板后拍干。
6.  每孔加显色剂 A 液 50µl，显色剂 B 液 50µl，振荡混匀后，37℃避光显色 15
分钟，每孔加终止液 50µl。
7.  用酶标仪读数，取波长 450nm，先用空白孔调零点，然后测定各孔 OD值。 
数据处理 数据处理 数据处理 数据处理
1.  手工作图：用双对数坐标纸，以标准品浓度为横轴，以对应的 0D值为纵轴，
画出平滑曲线或直线，在曲线上按照待测血清 OD值找到对应的浓度值。
2.  计算机：使用线性拟合功能，应将标准品 S1-S5 的浓度取对数（Log（浓度））
作为X，将对应的OD值减去空白对照孔OD值后取对数 （Log（OD值-NSB））
作为 Y，进行线性拟合。再从拟合线上计算出待测血清浓度。
注意事项 注意事项 注意事项 注意事项
1.  从冷藏环境中取出的试剂盒内全部瓶装试剂及所需预包被板条应置室温
（18-25℃）平衡 30 分钟后方可使用，余者应及时封好口，放回 2-8℃中避光保
存，以备后用。
2.  使用前试剂应摇匀。
3.  结果判断须在反应终止后 10 分钟内完成。
4.  不同批号的试剂不可混用。
5.  加样时应注意避免所用各试剂及样品之间的交又污染。
6.  操作时，试剂盒内每种试剂各使用一个吸头，每一种标准品使用一个吸头，
每一个样品各使用一个吸头，吸头一次性使用。        
 

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