Rabbit tumor necrosis factor α  
（TNF-α） ELISA Kit
 
Catalog No. CSB-E06998Rb
（96 tests）
 
 
 
 
  This  immunoassay kit allows  for  the  in vitro quantitative determination of  rabbit
TNF-α concentrations in serum, plasma and other biological fluids.
  Expiration date      six months from the date of manufacture
  FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES. 
 
 
  2
INTRODUCTION
The  prototype  ligand  of  the  TNF  superfamily,  TNF-α/TNFSF1A,  is  a
pleiotropic cytokine that plays a central role in inflammation and apoptosis.
It  is  synthesized as a  26  kDa,  type  II  transmembrane protein  that  is  233
amino acids in length. It contains a 30 amino acid （aa） cytoplasmic domain,
a  26  aa  transmembrane  segment,  and  a  177  aa  extracellular  region.
TNF-αis  assembled  intracellularly  to  form  a  transmembrane,
non-covalently-linked  homotrimeric  protein.  The  157  aa  residue  soluble
form  of  TNF-α（sTNF-αis  released  from  the  C-terminus  of  the  
transmembrane  protein  through  the  activity  of  TNF-α-converting  enzyme
（TACE）,  a membrane  -bound  disintegrin metalloproteinase.  Human  cells
known  to express TNF-αinclude B  cells,  colonic  columnar epithelial  cells,
NK and CD3+CD56+ hepatic natural T cells, macrophages, monocytes and
monocyte-derived  dendritic  cells,  CD4+  and  CD8+  T  cells,  mast  cells,
neutrophils, keratinocytes, plasma cells, and adipocytes.  
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The  microtiter  plate  provided  in  this  kit  has  been  pre-coated  with  an
antibody  specific  to TNF-α. Standards  or  samples  are  then  added  to  the
appropriate  microtiter  plate  wells  with  a  biotin-conjugated  polyclonal
antibody  preparation  specific  for  TNF-α  and  Avidin  conjugated  to
Horseradish  Peroxidase  （HRP）  is  added  to  each  microplate  well  and 
  3
incubated. Then a TMB （3,3'5, 5'  tetramethyl-benzidine） substrate solution
is  added  to  each  well.  Only  those  wells  that  contain  TNF-α,
biotin-conjugated  antibody  and  enzyme-conjugated  Avidin  will  exhibit  a
change  in  color.  The  enzyme-substrate  reaction  is  terminated  by  the
addition  of  a  sulphuric  acid  solution  and  the  color  change  is  measured
spectrophotometrically  at  a  wavelength  of  450  nm  ±  2  nm.  The
concentration of TNF-α in the samples is then determined by comparing the
O.D. of the samples to the standard curve.
DETECTION RANGE
78  pg/ml-5000  pg/ml.  The  standard  curve  concentrations  used  for  the
ELISA’s were 5000 pg/ml, 2500 pg/ml, 1250 pg/ml, 625 pg/ml, 312 pg/ml,
156 pg/ml, 78 pg/ml.
SPECIFICITY
This assay recognizes recombinant and natural rabbit TNF-α. No significant
cross-reactivity or interference was observed.
SENSITIVITY
The minimum  detectable  dose  of  rabbit TNF-α  is  typically  less  than  19.5
pg/ml.
The sensitivity of this assay, or Lower Limit of Detection （LLD） was defined 
  4
as the lowest protein concentration that could be differentiated from zero.
MATERIALS PROVIDED
Reagent      Quantity
Assay plate  1
Standard  2
Sample Diluent      1 x 20 ml
Biotin-antibody Diluent      1 x 10 ml
HRP-avidin Diluent        1 x 10 ml
Biotin-antibody      1 x 120l
HRP-avidin  1 x 120l
Wash Buffer      
1 x 20 ml
  （25×concentrate）
TMB Substrate      1 x 10 ml
Stop Solution      1 x 10 ml
STORAGE
1.  Unopened  test  kits  should  be  stored  at  2-8°C  upon  receipt  and  the
microtiter  plate  should  be  kept  in  a  sealed  bag  with  desiccants  to
minimize exposure to damp air. The test kit may be used throughout the
expiration date of  the kit. Refer  to  the package  label  for  the expiration
date.
2.  Opened  test  kits  will  remain  stable  until  the  expiring  date  shown,
provided it is stored as prescribed above.     
  5
3.  A  microtiter  plate  reader  with  a  bandwidth  of  10  nm  or  less  and  an
optical  density  range  of  0-3  OD  or  greater  at  450nm  wavelength  is
acceptable for use in absorbance measurement.
REAGENT PREPARATION
Bring all reagents to room temperature before use.  
1.  Wash  Buffer    If  crystals  have  formed  in  the  concentrate,  warm  to
room  temperature  and  mix  gently  until  the  crystals  have  compley
dissolved. Dilute 20 ml of Wash Buffer Concentrate  into deionized or
distilled water to prepare 500 ml of Wash Buffer.
2.  Standard    Reconstitute the Standard with 1.0 ml of Sample Diluent.
This  reconstitution produces a stock solution of 5000 pg/ml. Allow  the
standard to sit for a minimum of 15 minutes with gentle agitation prior to
making  serial  dilutions.  The  undiluted  standard  serves  as  the  high
standard  （5000  pg/ml）.  The  Sample  Diluent  serves  as  the  zero
standard （0 pg/ml）.
3.  Biotin-antibody    Dilute  to  the working concentration specified on  the
vial label using Biotin-antibody Diluent（1:100）, respectively.
4.  HRP-avidin    Dilute  to  the working concentration specified on  the vial
label using HRP-avidin Diluent（1:100）, respectively.
Precaution: The Stop Solution provided with this kit is an acid solution. Wear
eye, hand, face, and clothing protection when using this material.
OTHER SUPPLIES REQUIRED
  Microplate  reader  capable  of measuring  absorbance  at  450  nm, with 
  6
the correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.
  Pipettes and pipette tips.
  Deionized or distilled water.
  Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer.
SAMPLE COLLECTION AND STORAGE
  Cell Culture Supernates    Remove particulates by centrifugation and
assay immediay or aliquot and store samples at-20° C. Avoid
repeated freeze-thaw cycles.
  Serum    Use a serum separator  tube （SST） and allow samples  to clot
for 30 minutes before centrifugation for 15 minutes at 1000 x g. Remove
serum and assay  immediay or aliquot and  store  samples at-20° C.
Avoid repeated freeze-thaw cycles.
  Plasma    Collect plasma using citrate, EDTA, or heparin as an
anticoagulant. Centrifuge for 15 minutes at 1000 x g within 30 minutes
of collection. Assay immediay or aliquot and store samples at-20° C.
Avoid repeated freeze-thaw cycles.
Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay.
ASSAY PROCEDURE
Bring all reagents and samples to room temperature before use. It is
recommended that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.
1.  Add  100l  of  Standard,  Blank,  or  Sample  per  well.  Cover  with  the
adhesive strip. Incubate for 2 hours at 37° C.   
  7
2.  Remove the liquid of each well, don’t wash.  
3.  Add 100l of Biotin-antibody working solution  to each well.  Incubate
for  1  hour  at  37°C.  Biotin-antibody  working  solution  may  appear
cloudy.  Warm  to  room  temperature  and  mix  gently  until  solution
appears uniform.
4.  Aspirate each well and wash,  repeating  the process  three  times  for a
total of three washes. Wash by filling each well with Wash Buffer （350l）
using  a  squirt  bottle,  multi-channel  pipette,  manifold  dispenser  or
autowasher.  Complete  removal  of  liquid  at  each  step  is  essential  to
good  performance. After  the  last wash,  remove  any  remaining Wash
Buffer  by  aspirating  or  decanting.  Invert  the  plate  and  blot  it  against
clean paper towels.
5.  Add  100l  of  HRP-avidin  working  solution  to  each  well.  Cover  the
microtiter plate with a new adhesive strip. Incubate for 1 hours at 37° C.
6.  Repeat the aspiration and wash three times as step 4.
7.  Add 90l of TMB Substrate  to each well.  Incubate  for 30 minutes at
37°C.  Keeping  the  plate  away  from  drafts  and  other  temperature
fluctuations in the dark.
8.  Add  50l  of  Stop  Solution  to  each  well.  If  color  change  does  not
appear uniform, gently tap the plate to ensure thorough mixing.
9.  Determine  the optical density of each well within 30 minutes, using a
microplate reader set to 450 nm.
CALCULATION OF RESULTS 
  8
Average the duplicate readings for each standard, control, and sample and
subtract the average zero standard optical density. Create a standard curve
by reducing the data using computer software capable of generating a four
parameter  logistic  （4-PL） curve-fit. As an alternative, construct a standard
curve  by  plotting  the mean  absorbance  for  each  standard  on  the  y-axis
against the concentration on the x-axis and draw a best fit curve through the
points on  the graph. The data may be  linearized by plotting  the  log of  the
TNF-α concentrations versus the log of the O.D. and the best fit line can be
determined  by  regression  analysis.  This  procedure  will  produce  an
adequate but less precise fit of the data. If samples have been diluted, the
concentration  read  from  the  standard  curve  must  be  multiplied  by  the
dilution factor.
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
  The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.
  Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.
  It is important that the Calibrator Diluent selected for the standard curve
be consistent with the samples being assayed.
  If samples generate values higher than the highest standard, dilute the
samples with the appropriate Calibrator Diluent and repeat the assay.
  Any  variation  in  Standard  Diluent,  operator,  pipetting  technique,
washing  technique,  incubation  time  or  temperature,  and  kit  age  can
cause variation in binding. 
  9
  This assay  is designed  to eliminate  interference by soluble  receptors,
binding proteins, and other  factors present  in biological samples. Until
all  factors  have  been  tested  in  the  Quantikine  Immunoassay,  the
possibility of interference cannot be excluded.
TECHNICAL HINTS
  When mixing or reconstituting protein solutions, always avoid foaming.
  To avoid cross-contamination, change pipette tips between additions of
each standard  level, between sample additions, and between  reagent
additions. Also, use separate reservoirs for each reagent.
  When  using  an  automated  plate  washer,  adding  a  30  second  soak
period  following  the  addition  of wash  buffer,  and/or  rotating  the  plate
180 degrees between wash steps may improve assay precision.
  To  ensure  accurate  results,  proper  adhesion  of  plate  sealers  during
incubation steps is necessary.
  Substrate  Solution  should  remain  colorless  until  added  to  the  plate.
Keep Substrate Solution protected from light. Substrate Solution should
change from colorless to gradations of blue.
  Stop Solution  should be added  to  the plate  in  the  same order as  the
Substrate Solution. The color developed in the wells will turn from blue
to  yellow  upon  addition  of  the Stop Solution. Wells  that  are  green  in
color indicate that the Stop Solution has not mixed thoroughly with the
Substrate Solution.
 
  10
 
 
 
兔子肿瘤坏死因子 兔子肿瘤坏死因子 兔子肿瘤坏死因子 兔子肿瘤坏死因子 α（TNF-α）酶联免疫分析 酶联免疫分析 酶联免疫分析 酶联免疫分析
试剂盒使用说明书 试剂盒使用说明书 试剂盒使用说明书 试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用 本试剂盒仅供研究使用 本试剂盒仅供研究使用 本试剂盒仅供研究使用
产品编号 产品编号 产品编号 产品编号： ：： ：CSB-E06998Rb
检测范围 检测范围 检测范围 检测范围： ：： ：78 pg/ml - 5000 pg/ml
zui低检测限 zui低检测限 zui低检测限 zui低检测限： ：： ：19.5 pg/ml
特异性 特异性 特异性 特异性： ：： ：本试剂盒可同时检测天然或重组的兔子 TNF-α，且与其他相关蛋
白无交叉反应。
有效期 有效期 有效期 有效期： ：： ：6 个月
预期应用 预期应用 预期应用 预期应用： ：： ：ELISA 法定量测定兔子血清、血浆或其它相关生物液体中
TNF-α 含量。
说明 说明 说明 说明  
1.  试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
2.  浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。  
3.  中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
4.  刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实
验结果造成任何影响。
实验原理 实验原理 实验原理 实验原理 
  11
用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗 TNF-α 抗体的微孔
中依次加入标本或标准品、*化的抗 TNF-α 抗体、HRP 标记的亲和素，
经过*洗涤后用底物 TMB 显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，
并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的TNF-α呈正相关。
用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。  
试剂盒组成及试剂配制 试剂盒组成及试剂配制 试剂盒组成及试剂配制 试剂盒组成及试剂配制  
1.  酶联板 酶联板 酶联板 酶联板（Assay plate ）：                                                              一块 （96孔）。   
2.  标准品 标准品 标准品 标准品 （Standard）：                                                                   2 瓶（冻干品）。 
3.  样品稀释液 样品稀释液 样品稀释液 样品稀释液（Sample Diluent）：                                                     1×20ml/瓶。 
4.  *标记抗体稀释液 *标记抗体稀释液 *标记抗体稀释液 *标记抗体稀释液（ （（ （Biotin-antibody Diluent） ）） ）：               1×10ml/瓶。 
5.  辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液（ （（ （HRP-avidin Diluent） ）） ）：1×10ml/瓶。 
6.  *标记抗体 *标记抗体 *标记抗体 *标记抗体 （ （（ （Biotin-antibody） ）） ）：                         1×120l/瓶（1： 100）。 
7.  辣根过氧化物酶标记亲和素 辣根过氧化物酶标记亲和素 辣根过氧化物酶标记亲和素 辣根过氧化物酶标记亲和素 （ （（ （HRP-avidin） ）） ）：             1×120l/瓶（1： 100）。 
8.  底物溶液 底物溶液 底物溶液 底物溶液 （ （（ （TMB Substrate） ）） ）：                                                       1×10ml/瓶。   
9.  浓洗涤液 浓洗涤液 浓洗涤液 浓洗涤液（ （（ （Wash Buffer） ）） ）  1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释 25 倍。   
10. 终止液 终止液 终止液 终止液 （ （（ （Stop Solution） ）） ）：                                       1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 
需要而未提供的试剂和器材 需要而未提供的试剂和器材 需要而未提供的试剂和器材 需要而未提供的试剂和器材
1.  标准规格酶标仪
2.  高速离心机
3.  电热恒温培养箱
4.  干净的试管和 Eppendof 管
5.  系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，用多通道移液器
6.  蒸馏水，容量瓶等
标本的采集及保存 标本的采集及保存 标本的采集及保存 标本的采集及保存  
1.  血清：全血标本请于室温放置 2 小时或 4℃过夜后于 1000 x g离心 20 分
钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻
融。 
  12
2.  血浆：可用 EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后 30 分钟内于 2 - 8° C
1000 x g离心 15 分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复
冻融。
3.  细胞培养物上清或其它生物标本：1000 x g离心 20 分钟，取上清即可检
测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
注 注注 注： ：： ：标本溶血会影响zui后检测结果 标本溶血会影响zui后检测结果 标本溶血会影响zui后检测结果 标本溶血会影响zui后检测结果， ，， ，因此溶血标本不宜进行此项检测 因此溶血标本不宜进行此项检测 因此溶血标本不宜进行此项检测 因此溶血标本不宜进行此项检测。 。。 。
标本的稀释原则 标本的稀释原则 标本的稀释原则 标本的稀释原则： ：： ：
首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。
只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应
做好详细的记录。zui后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。 
标准品的稀释原则 标准品的稀释原则 标准品的稀释原则 标准品的稀释原则： ：： ：2 瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至 1ml，盖好
后静置 10 分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为 5000  pg/ml，
做系列倍比稀释后，分别稀释 5000  pg/ml，2500  pg/ml，1250  pg/ml，625
pg/ml，312  pg/ml，156  pg/ml，78  pg/ml，样品稀释液直接作为标准浓度 0
pg/ml，临用前 15 分钟内配制。
如配制 2500  pg/ml标准品：取 0.5ml（不要少于 0.5ml）5000  pg/ml的上述
标准品加入含 0.5ml 样品稀释液的 Eppendorf 管中，混匀即可，其余浓度以
此类推。
*标记抗体的稀释原则 *标记抗体的稀释原则 *标记抗体的稀释原则 *标记抗体的稀释原则： ：： ：
临用前以*标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所
需的总量配制（每孔 100l），实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。如 10l 生物
素标记抗体加 990l *标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用
前一小时内配制。
辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则 辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则 辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则 辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则： ：： ：
临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的
每次实验所需的总量配制（每孔 100l），实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。如
  13
10l 辣根过氧化物酶标记亲和素加 990l 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释
液 的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
操作步骤 操作步骤 操作步骤 操作步骤
实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀
时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品
稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1.  加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100l，
余孔分别加标准品或待测样品 100l，注意不要有气泡，加样将样品加于
酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，
37℃反应 120 分钟。
为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2.  弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加*标记抗体工作液  100l （取 1l
*标记抗体加 99l *标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，
在使用前一小时内配制），37 ,60 ℃ 分钟。
3.  温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2分钟，
350l/每孔，甩干。  
4.  每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同*标记抗体工作液）
100l，37℃，60 分钟。
5.  温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2分钟，
350l/每孔，甩干。
6.  依序每孔加底物溶液 90l，37℃避光显色（ （（ （30 分钟内，此时肉眼可见标
准品的前 3-4 孔有明显的梯度蓝色，后 3-4 孔梯度不明显，即可终止）。
7.  依序每孔加终止溶液 50l，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加
入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底
物反应时间到后应尽快加入终止液。
8.  用酶联仪在 450nm 波长依序测量各孔的光密度（OD 值）。 在加终止液
后 15 分钟以内进行检测。
实验备注 实验备注 实验备注 实验备注
1.  本操作说明适用于 本操作说明适用于 本操作说明适用于 本操作说明适用于 48T 试剂盒 试剂盒 试剂盒 试剂盒， ，， ，但 但但 但 48T 试剂盒所有试剂减半 试剂盒所有试剂减半 试剂盒所有试剂减半 试剂盒所有试剂减半。 。。 。
2.  用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到
管底。
3.  每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是zui后加底物溶
  14
液及 2N H2SO4。测量时先用此孔调 OD值至零。  
4.  为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上
盖或覆膜。
5.  未使用完的酶标板或者试剂，请于 2-8℃保存。标准品、*标记抗体
工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请
勿重复使用已稀释过的标准品、*标记抗体工作液或、辣根过氧化物
酶标记亲和素工作液。
6.  建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。