Rat Neuron-Specific Enolase （NSE）
ELISA Kit 
 
 
 
  This immunoassay kit allows for the in vitro quantitative determination of rat
NSE  concentrations  in  cell  culture  supernates,  serum,  plasma  and  other
biological fluids.
  Expiration date      six months from the date of manufacture
  FOR  RESEARCH  USE  ONLY.  NOT  FOR  USE  IN  DIAGNOSTIC
PROCEDURES. 
 
 
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INTRODUCTION
Neuron  Specific  Enolase  （NSE）  is  the  most  abundant  form  of  the  glycolytic
enolase  found  in  adult  neurons  and  is  thought  to  serve  as  a  growth  factor  in
neurons. Of  the  three enolase subunits （α, β, and γ）, NSE  is a dimer composed of
two γ subunits.
NSE is useful in studying neuronal differentiation and is, therefore, a valuable tool
for visualizing the entire neuron and endocrine systems. Serum levels of NSE have
been  associated  with  such  disease  states  as  Alzheimer's,  Huntington's  Chorea,
neuroblastoma,  head  trauma,  neuroendocrine  malignancies,  and  small  cell
carcinomas of the lung.
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The  microtiter  plate  provided  in  this  kit  has  been  pre-coated  with  an  antibody
specific to NSE. Standards or samples are then added to the appropriate microtiter
plate wells with  a  biotin-conjugated  polyclonal  antibody  preparation  specific  for
NSE  and Avidin  conjugated  to Horseradish  Peroxidase  （HRP）  is  added  to  each
microplate  well  and  incubated.  Then  a  TMB  （3,3'5,  5'  tetramethyl-benzidine）
substrate  solution  is  added  to  each  well.  Only  those  wells  that  contain  NSE,
biotin-conjugated antibody and enzyme-conjugated Avidin will exhibit a change in
color. The enzyme-substrate  reaction  is  terminated by  the addition of a sulphuric
acid  solution  and  the  color  change  is  measured  spectrophotometrically  at  a
wavelength of 450 nm ± 2 nm. The concentration of NSE  in  the  samples  is  then
determined by comparing the O.D. of the samples to the standard curve.
DETECTION RANGE
0.625  ng/ml-40  ng/ml.  The  standard  curve  concentrations  used  for  the  ELISA’s
were 40 ng/ml, 20 ng/ml, 10 ng/ml, 5 ng/ml, 2.5 ng/ml, 1.25 ng/ml, 0.625 ng/ml. 
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SPECIFICITY
This  assay  recognizes  recombinant  and  natural  rat  NSE.  No  significant
cross-reactivity or interference was observed.
SENSITIVITY
The minimum detectable dose of rat NSE is typically less than 0.156 ng/ml.
The  sensitivity of  this assay, or Lower Limit of Detection  （LLD） was defined as
the lowest protein concentration that could be differentiated from zero.
MATERIALS PROVIDED
Reagent      Quantity
Assay plate  1
Standard  2
Sample Diluent      1 x 20 ml
Biotin-antibody Diluent      1 x 10 ml
HRP-avidin Diluent        1 x 10 ml
Biotin-antibody      1 x 120l
HRP-avidin  1 x 120l
Wash Buffer      
1 x 20 ml
  （25×concentrate）
TMB Substrate      1 x 10 ml
Stop Solution      1 x 10 ml
STORAGE
1.  Unopened  test kits  should be  stored at 2-8°C upon  receipt and  the microtiter
plate  should be kept  in a  sealed bag with desiccants  to minimize exposure  to
damp  air. The  test kit may be used  throughout  the  expiration date of  the kit.
Refer to the package label for the expiration date. 
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2.  Opened test kits will remain stable until the expiring date shown, provided it is
stored as prescribed above.    
3.  A microtiter  plate  reader with  a  bandwidth  of  10  nm  or  less  and  an  optical
density range of 0-3 OD or greater at 450nm wavelength is acceptable for use
in absorbance measurement.
REAGENT PREPARATION
Bring all reagents to room temperature before use.  
1.  Wash Buffer    If crystals have  formed  in  the concentrate, warm up  to  room
temperature  and  mix  gently  until  the  crystals  have  compley  dissolved.
Dilute 20 ml of Wash Buffer Concentrate  into deionized or distilled water  to
prepare 500 ml of Wash Buffer.
2.  Standard    Reconstitute  the Standard with 1.0 ml of Sample Diluent. This
reconstitution produces a stock solution of 40 ng/ml. Allow the standard to sit
for  a  minimum  of  15  minutes  with  gentle  agitation  prior  to  making  serial
dilutions. The undiluted standard serves as  the high standard （40 ng/ml）. The
Sample Diluent serves as the zero standard （0 ng/ml）.
3.  Biotin-antibody    Dilute  to  the working  concentration  specified  on  the  vial
label using Biotin-antibody Diluent（1:100）, respectively.
4.  HRP-avidin    Dilute  to  the working concentration specified on  the vial  label
using HRP-avidin Diluent（1:100）, respectively.
Precaution: The Stop Solution provided with this kit is an acid solution. Wear
eye, hand, face, and clothing protection when using this material.
OTHER SUPPLIES REQUIRED
  Microplate  reader  capable  of  measuring  absorbance  at  450  nm,  with  the
correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.
  Pipettes and pipette tips.
  Deionized or distilled water.
  Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer. 
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SAMPLE COLLECTION AND STORAGE
  Cell Culture Supernates    Remove particulates by centrifugation and assay
immediay or aliquot and store samples at -20° C. Avoid repeated
freeze-thaw cycles.
  Serum    Use a  serum  separator  tube  （SST） and allow  samples  to clot  for 30
minutes  before  centrifugation  for  15 minutes  at  1000  g. Remove  serum  and
assay  immediay  or  aliquot  and  store  samples  at  -20°  C.  Avoid  repeated
freeze-thaw cycles.
  Plasma    Collect plasma using citrate, EDTA, or heparin as an anticoagulant.
Centrifuge for 15 minutes at 1000 g within 30 minutes of collection. Assay
immediay or aliquot and store samples at -20° C. Avoid repeated
freeze-thaw cycles.
Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay.
ASSAY PROCEDURE
Bring all reagents and samples to room temperature before use. It is
recommended that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.
1.  Add 100l of Standard, Blank, or Sample per well. Cover with  the adhesive
strip. Incubate for 2 hours at 37° C.  
2.  Remove the liquid of each well, don’t wash.  
3.  Add 100l of Biotin-antibody working solution  to each well.  Incubate  for 1
hour at 37°C. Biotin-antibody working solution may appear cloudy. Warm up
to room temperature and mix gently until solution appears uniform.
4.  Aspirate each well and wash,  repeating  the process  three  times  for a  total of
three washes. Wash  by  filling  each well with Wash Buffer  （200l）  using  a
squirt  bottle,  multi-channel  pipette,  manifold  dispenser  or  autowasher.
Complete  removal  of  liquid  at  each  step  is  essential  to  good  performance.
After  the  last  wash,  remove  any  remaining  Wash  Buffer  by  aspirating  or
decanting. Invert the plate and blot it against clean paper towels. 
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5.  Add 100l of HRP-avidin working solution to each well. Cover the microtiter
plate with a new adhesive strip. Incubate for 1 hour at 37°C.
6.  Repeat the aspiration and wash three times as step 4.
7.  Add 90l of TMB Substrate  to each well.  Incubate  for 30 minutes at 37°C.
Keeping  the plate away  from drafts and other  temperature fluctuations  in  the
dark.
8.  Add  50l  of  Stop  Solution  to  each  well.  If  color  change  does  not  appear
uniform, gently tap the plate to ensure thorough mixing.
9.  Determine  the  optical  density  of  each  well  within  30  minutes,  using  a
microplate reader set to 450 nm.
CALCULATION OF RESULTS
Average the duplicate readings for each standard, control, and sample and subtract
the average zero standard optical density. Create a standard curve by reducing the
data using computer software capable of generating a four parameter logistic （4-PL）
curve-fit.  As  an  alternative,  construct  a  standard  curve  by  plotting  the  mean
absorbance for each standard on the y-axis against the concentration on the x-axis
and  draw  a  best  fit  curve  through  the  points  on  the  graph.  The  data  may  be
linearized by plotting the log of the NSE concentrations versus the log of the O.D.
and the best fit line can be determined by regression analysis. This procedure will
produce an adequate but  less precise fit of  the data. If samples have been diluted,
the concentration read from  the standard curve must be multiplied by  the dilution
factor.
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
  The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.
  Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.
  It is important that the Calibrator Diluent selected for the standard curve be
consistent with the samples being assayed. 
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  If samples generate values higher than the highest standard, dilute the samples
with the appropriate Calibrator Diluent and repeat the assay.
  Any  variation  in  Standard  Diluent,  operator,  pipetting  technique,  washing
technique,  incubation  time or  temperature, and kit age can cause variation  in
binding.
  This assay  is designed  to eliminate  interference by soluble receptors, binding
proteins, and other factors present in biological samples. Until all factors have
been  tested  in  the  Quantikine  Immunoassay,  the  possibility  of  interference
cannot be excluded.
TECHNICAL HINTS
  When mixing or reconstituting protein solutions, always avoid foaming.
  To avoid cross-contamination, change pipette  tips between additions of each
standard level, between sample additions, and between reagent additions. Also,
use separate reservoirs for each reagent.
  When  using  an  automated  plate  washer,  adding  a  30  second  soak  period
following  the  addition  of wash  buffer,  and/or  rotating  the  plate  180  degrees
between wash steps may improve assay precision.
  To ensure accurate results, proper adhesion of plate sealers during  incubation
steps is necessary.
  Substrate  Solution  should  remain  colorless  until  added  to  the  plate.  Keep
Substrate  Solution  protected  from  light.  Substrate  Solution  should  change
from colorless to gradations of blue.
  Stop Solution should be added  to  the plate  in  the same order as  the Substrate
Solution. The color developed in the wells will turn from blue to yellow upon
addition of  the Stop Solution. Wells  that  are green  in  color  indicate  that  the
Stop Solution has not mixed thoroughly with the Substrate Solution. 
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大鼠神经特异性烯醇化酶 大鼠神经特异性烯醇化酶 大鼠神经特异性烯醇化酶 大鼠神经特异性烯醇化酶（NSE）酶联免疫分析 酶联免疫分析 酶联免疫分析 酶联免疫分析
试剂盒使用说明书 试剂盒使用说明书 试剂盒使用说明书 试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研 本试剂盒仅供研 本试剂盒仅供研 本试剂盒仅供研究使用 究使用 究使用 究使用
产品编号 产品编号 产品编号 产品编号： ：： ：CSB-E07963r
检测范围 检测范围 检测范围 检测范围： ：： ：0.625 ng/ml - 40 ng/ml
zui低检测限 zui低检测限 zui低检测限 zui低检测限： ：： ：0.156 ng/ml
特异性 特异性 特异性 特异性： ：： ：本试剂盒可同时检测天然或重组的大鼠 NSE，且与其他相关蛋白
无交叉反应。
有效期 有效期 有效期 有效期： ：： ：6 个月
预期应用 预期应用 预期应用 预期应用： ：： ：ELISA 法定量测定大鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关
生物液体中 NSE含量。
说明 说明 说明 说明  
1.  试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
2.  浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。  
3.  中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
4.  刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实
验结果造成任何影响。
概述 概述 概述 概述
        烯醇化酶（Enolase）是参与糖酵解的酶，催化 2-磷酸甘油酸向磷酸烯醇
丙酮酸的转化，由三种亚基（α、β、γ）组成的二聚体同功酶。其中 ag  和  gg
烯醇化酶同功酶存在于神经元及神经来源的细胞中，也称为神经元特异性烯
醇化酶（Neurone specific enolase  ，NSE）。在正常人群中 NSE含量较低，但
在某些神经内皮细胞增生的恶性疾病，如神经母细胞瘤（Neuroblastoma），其
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含量往往上升。由于小细胞肺癌（Small cell  lung  carcinoma，SCLC）是zui常
表现有神经内分泌性质的肿瘤，目前 NSE也是 SCLC zui敏感zui特异的肿瘤标
志物。肺癌是近年来发病率日趋增高的癌种，在种种肺癌中小细胞肺癌占大
约 20%，因此正确诊断肺癌的类型，特别是确定小细胞肺癌的诊断很重要。
小细胞肺癌患者的 ag  和  gg同功酶含量均有不同比例的增高，因些必须在同
一敏感度下同时检测 NSE的 ag和  gg同功酶含量。本试剂盒所用单抗只针对
NSE 的 g 亚基，而与 a 或 β 亚基无交差反应。据文献报道，NSE 含量测定可
作为肺癌、成神经细胞瘤、黑素瘤、精原细胞瘤以及中枢精神系统损伤的诊
断指标。同时，也可用于 SCLC 治疗前后疗效的监测与预后，以及 SCLC 与
其它型肺癌的鉴别诊断。
实验原理 实验原理 实验原理 实验原理
用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗 NSE抗体的微孔中
依次加入标本或标准品、*化的抗 NSE抗体、HRP 标记的亲和素，经过
*洗涤后用底物 TMB 显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并
在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的 NSE呈正相关。用
酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。  
试剂盒组成及试剂配制 试剂盒组成及试剂配制 试剂盒组成及试剂配制 试剂盒组成及试剂配制  
1.  酶联板 酶联板 酶联板 酶联板（Assay plate ）：                                                                一块（96 孔）。   
2.  标准品 标准品 标准品 标准品 （Standard）：                                                                     2 瓶（冻干品）。 
3.  样品稀释液 样品稀释液 样品稀释液 样品稀释液（Sample Diluent）：                                                      1×20ml/瓶。 
4.  *标记抗体稀释液 *标记抗体稀释液 *标记抗体稀释液 *标记抗体稀释液（ （（ （Biotin-antibody Diluent） ）） ）：                   1×10ml/瓶。 
5.  辣根过氧化物酶标记亲和素稀 辣根过氧化物酶标记亲和素稀 辣根过氧化物酶标记亲和素稀 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 释液 释液 释液 （ （（ （HRP-avidin Diluent） ）） ）：  1×10ml/瓶。 
6.  *标记抗体 *标记抗体 *标记抗体 *标记抗体（ （（ （Biotin-antibody） ）） ）：                        1×120l/瓶（1：100）。 
7.  辣根过氧化物酶标记亲和素 辣根过氧化物酶标记亲和素 辣根过氧化物酶标记亲和素 辣根过氧化物酶标记亲和素（ （（ （HRP-avidin） ）） ）：            1×120l/瓶（1：100）。 
8.  底物溶液 底物溶液 底物溶液 底物溶液（ （（ （TMB Substrate） ）） ）：                                                      1×10ml/瓶。   
9.  浓洗涤液 浓洗涤液 浓洗涤液 浓洗涤液（ （（ （Wash Buffer） ）） ）：     1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释 25 倍。   
10. 终止液 终止液 终止液 终止液 （ （（ （Stop Solution） ）） ）：                                             1×10ml/瓶（2N H2SO4）。  
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需要而未提供的试剂和器材 需要而未提供的试剂和器材 需要而未提供的试剂和器材 需要而未提供的试剂和器材
1.  标准规格酶标仪
2.  高速离心机
3.  电热恒温培养箱
4.  干净的试管和 Eppendof管
5.  系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，用多通道移液器
6.  蒸馏水，容量瓶等
标本的采集及保存 标本的采集及保存 标本的采集及保存 标本的采集及保存  
1.  血清：全血标本请于室温放置 2 小时或 4℃过夜后于 1000g离心 20 分钟，
取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2.  血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8°C 1000
g离心 15 分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3.  细胞培养物上清或其它生物标本：1000g离心 20 分钟，取上清即可检测，
或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
注 注注 注： ：： ：标本溶血会影响zui后检测结果 标本溶血会影响zui后检测结果 标本溶血会影响zui后检测结果 标本溶血会影响zui后检测结果， ，， ，因此溶血标本不宜进行此项检测 因此溶血标本不宜进行此项检测 因此溶血标本不宜进行此项检测 因此溶血标本不宜进行此项检测。 。。 。
标本的稀释原则 标本的稀释原则 标本的稀释原则 标本的稀释原则： ：： ：
首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。
只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应
做好详细的记录。zui后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。 
标准 标准 标准 标准品的稀释原则 品的稀释原则 品的稀释原则 品的稀释原则： ：： ：2 瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至 1ml，盖好后
静置 10 分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为 40 ng/ml，做系列
倍比稀释后，分别稀释 40 ng/ml，20 ng/ml，10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，
1.25  ng/ml，0.625  ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度 0  ng/ml，临用前 15
分钟内配制。
如配制 20  ng/ml 标准品：取 0.5ml（不要少于 0.5ml）40  ng/ml 的上述标准品
加入含 0.5ml 样品稀释液的 Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 
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*标记抗体的稀释原则 *标记抗体的稀释原则 *标记抗体的稀释原则 *标记抗体的稀释原则： ：： ：
临用前以*标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所
需的总量配制（每孔 100l），实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。如 10l *
标记抗体加 990l *标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前
一小时内配制。
辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则 辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则 辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则 辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则： ：： ：
临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的
每次实验所需的总量配制（每孔 100l），实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。如
10l 辣根过氧化物酶标记亲和素加 990l 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释
液 的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
操作步骤 操作步骤 操作步骤 操作步骤
实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀
时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品
稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1.  加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100l，
余孔分别加标准品或待测样品 100l，注意不要有气泡，加样将样品加于
酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，
37℃反应 120 分钟。
为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2.  弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加*标记抗体工作液  100l（取 1l
*标记抗体加 99l *标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，
在使用前一小时内配制），37 ,60 ℃ 分钟。
3.  温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分钟，
200l/每孔，甩干。  
4.  每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同*标记抗体工作液）
100l，37℃，60 分钟。
5.  温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2 分钟，
200l/每孔，甩干。
6.  依序每孔加底物溶液 90l，37℃避光显色（ （（ （30 分钟内，此时肉眼可见标
准品的前 3-4 孔有明显的梯度蓝色，后 3-4 孔显色不明显，即可终止）。
7.  依序每孔加终止溶液 50l，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加
入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底
物反应时间到后应尽快加入终止液。
8.  用酶联仪在 450nm 波长依序测量各孔的光密度（OD值）。  在加终止液后
15 分钟以内进行检测。 
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实验备注 实验备注 实验备注 实验备注
1.  用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到
管底。
2.  每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是zui后加底物溶
液及 2N H2SO4。测量时先用此孔调 OD值至零。  
3.  为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上
盖或覆膜。
4.  未使用完的酶标板或者试剂，请于 2-8℃保存。标准品、*标记抗体
工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请
勿重复使用已稀释过的标准品、*标记抗体工作液、或辣根过氧化物
酶标记亲和素工作液。
5.  建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
洗板方法 洗板方法 洗板方法 洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上
铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少 0.3ml
注入孔内，浸泡 1-2 分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
计算 计算 计算 计算
以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对
数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度；
再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方
程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即
为样品的实际浓度。  
注意事项 注意事项 注意事项 注意事项
1.  当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。
2.  洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
3.  一次加样时间控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 
4.  请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。
5.  如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请zui后乘以稀释
倍数。
6.  在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。 
7.  底物请避光保存。
8.  不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。