病毒分离是诊断NDzui为确切的一种方法，并且可以为感染的毒株定性。通常采用鸡胚接种的方法分离NDV，也可用鸭胚、鹌鹑胚或鸡胚成纤维细胞等。病毒分离时取患病鸡的脑、脾、肺等组织的匀浆混合物，加抗生素处理后，接种于鸡胚或其他禽类胚的尿囊腔或鸡胚成纤维细胞中。组织样品须反复冻融3次以上，以确保病毒分离的成功。病料接种鸡胚后，一般培养36～96h鸡胚发生死亡，可见胚体的头、翅、颈、胸等处出血，尿囊液清朗，内含大量病毒，呈现较高的血凝性。分离病毒时还应结合相应的血凝和血凝抑制试验等方法进行检测，以便使结果更加可靠。病毒分离后需要进一步测其鸡胚平均死亡时间（MDT）、脑内致病指数（1CPl）、静脉致病指数（1VPD等一系列生物学指标。
该方法用于诊断ND，准确、可靠，但整个过程较为繁杂，耗时较长，因此，很难在基层兽医工作中得到广泛应用。
（1）样品采集 活禽用气管拭子和泄殖腔拭子（或粪便）；死禽以脑为主；也可采心、肝、脾、肾、气囊等组织。
（2）样品处理 样品用生理盐水或磷酸盐缓冲液（PBS）研成1；5乳液；拭子浸入2—3ml生理盐水或PBS缓冲液中，反复吸挤压至无水滴出，弃之。溶液中加入*（使终浓度为1000单位／mi）*（使终浓度为lmg／mi）泄殖腔拭子（或粪）样品，*、*量提高5倍。然后调pH 7．0～7．4，37~C作用1h，再1000r／rain离心10min，取上清0．1ml备用。
（3）病毒分离和鉴定 将病料接种9～lo日龄SPF鸡胚，经孵化后，检查尿囊液是否具有血凝性（HA）以及这种血凝性能否被新城疫特异抗血清所抑制（H1）。若有血凝性（HA效价>24）且血凝性能被特异血清所抑制，则证明分离到了新城疫病毒，但该病毒并不一定是致病的强毒，也有可能是疫苗毒÷因此必须对分离到的病毒进行致病力测定。
血凝和血凝抑制是进行新城疫病毒鉴定zui确实，也是zui有效的方法。至今OIE所采用的标准也一直是采用本方法进行鉴定。
