SPA可为多种示踪物（如荧光素、酶、胶体金、铁蛋白）所标记，应用较广泛的为酶标记SPA和金标记SPA技术。标记SPA常用的酶为HRP，可应用于间接法染色，SPA在PAP法中可代替桥抗体。
1．SPA—HRP在间接法中的应用
由于SPA能结合IgG的Fc段，因此就成为天然的抗IgG，酶标记的SPA可代替酶标记的IgG抗血清，从而测定和定位组织内的IgG或免疫复合物，SPA—HRP的染色步骤如下。
（1）石蜡切片常规脱蜡至水。
（2）3％H202处理15min，以抑制内源性过氧化物酶
（3）TBS洗3X3min。
（4）加*抗体，孵育30～60min，或4~C过夜。
（5）TBS洗3X 3min。
（6）加适当的稀释的SPA—HRP（1：100～1：400），孵育30—60min。
（7）TBS洗3X3min。
（8）DAB显色5—10min。
（9）复染、脱水、封片。
2．SPA在PAP法中的应用
SPA除与标记物结合后用于代替第二抗体外，其本身可作为桥抗体用于PAP染色。与标记SPA相似，SPA可与多种动物的*抗体反应外，还可与多种PAP复合物反应，而不像PAP法需要与*抗体相同的动物制备的各种PAP复合物。由于SPA与Fc段和Fab段结合为亲和化学反应，不是抗原—抗体的免疫反应，因而反应极为迅速，能大大减少实验时间。此法的敏感性不如PAP法，但背景染色要低于PAP法，而且较为方便。染色步骤如下。 （1）4gm石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗3X3rain。
（2）IHC的前处理视特异性一抗不同，可采用蛋白酶消化或热诱导的微波抗原修复（AR）。
（3）PBS洗3X3min。
（4）3％过氧化氢（Hz02）孵育10min（可省略），以阻断内源性过氧化物酶活性。
（5）PBS洗3X3min。
（6）20％蛋清[用0．01mol／L（pH7．3）PBS配制]孵育20min。
（7）PBS洗3X3min。
（8）10％非免疫性动物血清孵育10min（可省略），以减少非特异性背景，无需冲洗，只需吸去多余血清。
（9）滴加适当稀释的*抗体，37~C温育60min，或4~C过夜。
（10）PBS洗3X 3rain。
（11）加SPA（1ug／mi），37~C温育30rain。
（12）PBS洗3X3rain。
（13）PAP复合物（兔或鼠）37~C温育30min。
（14）PBS洗3X3rain。
（15）0．04％DAB（含0．03％Hz02）显色5～10min
（16）复染，脱水，常规树胶封固，结果观察。
