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公司动态

用免疫亲和反应选择gⅥ—cDKA噬菌体文库

阅读:572发布时间:2010-7-26

[器材和试剂]
●PBST
●牛血清蛋白(BSA)(Sigma)
●抗血清及gⅥ—cDNA噬菌体文库
●无菌15ml聚丙烯管(Falcon)
●立式旋转机
●蛋白A—琼脂糖凝胶珠(Amersham Biosciences)
●无菌0.1mol/L盐酸*,pH 2.2加0.1%(w/v)BSA
●无菌2mol/LTris碱(未调节pH)
●于板*0F,
●37℃培养箱
●LB
●LBAT平板
●无菌直径为16mm或18mm的培养管
●37℃振荡培养箱

[方法]
1.用10m1含1%(w/v)BSA的PBST稀释2.5ul抗血清,并倒入15ml聚丙烯管中,再加入1011~1012TU的gⅥ—cDNA噬菌体文库。
2.室温下缓慢旋转孵育该混合物1小时。
3.往混合物中加500ul 1/1(体积比)蛋白A—琼脂糖凝胶珠浆[在PBST用5%(w/v)BSA预处理],在室温下再孵育l小时。
4.离心(500g 5分钟)收集蛋白A—琼脂糖凝胶珠并且用10ml PBST冲洗蛋白A—琼脂糖凝胶珠10次。
5.在1ml PBST溶液中打散蛋白A—琼脂糖凝胶珠,将混合物转移到微离心管中并旋转(10000g 10秒),除去上清液。
6.0.5m1 0.1mol/L盐酸*,pH 2.2,并加入0.1%(w/v)BSA溶液中打散蛋白A—琼脂糖凝胶珠。
7.室温下孵育样品10分钟。
8.快速离心样品(10000g 10秒)并将上清液转移到一新的微离心管中。
9.加30ul 2mol/LTrls中和该溶液,在冰浴中保存溶液。
10.噬菌体扩增,将抽提出来的一半噬菌体(256ul)加到平板Topl0F’细胞中。37℃温育30分钟。

 


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