[器材和试剂]
通用设备及试剂
● 灭菌水
● 无菌微量离心试管
● 无菌移液枪及移液管枪头
● 微型离心机
● 台式离心机
A部分
● 无菌的0．2ml的细壁聚丙烯微型离心管
● pfuDNA聚合酶（Stratagene）
● 10×pfu缓冲液， 由提供PfuDNA聚合酶的厂商提供
● dNTP混合液（每个10mmol/L）
● λGTll正向引物 （NeW England Biolabs， #1218 5’-GGTGGCGACGACCCTGGAGCCCG-3’）
● λGTll反向引物（New England Biolabs， #1222 5’-TTGACACCAGACCAACTGGTAATG-3’）
● 已制备好的SfiI-NotIλGTll cDNA文库[滴度≥109pfu（噬菌斑形成单位）/ml]
● 矿物油
● 自动PCR扩增仪
B部分
● QIAquickPCR扩增试剂盒（Qlagen）
● 限制性内切酶及相应的10×限制性内切酶缓冲液
C部分
● 琼脂糖
● TAE缓冲液（50X）：2 mol/LTris-乙酸盐，50mmol/LEDTA（pH 8．0）
● 0．5mg/ml溴化乙锭（1000×stock）
● 6×凝胶上样液[0.25%（w/v）溴酚蓝，0．25%（w/v）二甲苯腈蓝FF以及30%（体积分数）的甘油水溶液]
● 琼脂糖凝胶电泳盒
● UV transilluminator
● 无菌的15m1的聚丙烯管
● 无菌刀
● Geneclean（Qbiogene）或Wizard PCR DNA预纯化系统（Promega）
● DNA浓度测量试剂盒（Invitrogen）
[方法]
A.PCR扩增cDNA插入片段
1．在冰浴中将以下成分加到0．2m1微量离心管中（执行10步反应）
● 水，36．5ul
● 10×Pfu缓冲液，5．0ul
● 10mmol/L dNTP， 1．5ul
● λGTll正向引物 （10umol/L），2．5ul
● λGTll反向引物（10umol/L），2．5ul
● 已制备好的Sfi-NotIλGTll cDNA文库，1．Oul
● PfuDNA聚合酶（2．5U/ul），1．0ul
2．混合反应物并用50ul的矿物油覆盖。
3．在95℃下使模板变性2分钟，按如下操作执行25次循环： （a）95℃变性1分钟； （b）50℃退火1分钟；（c）72℃延伸3分钟（zui后一轮的延伸时间增加到7分钟）。
B．纯化并用限制性内切酶消化扩增的cDNA片段
1．纯化在A部分中用QIAquick PCR扩增仪器得到了PCR产物，每两个PCR反应用一个旋转柱并在30ul的水中提取纯化的PCR产物。
2．收集提取的PCR产物，如下所示建立限制性消化：
● 水，25ul
● 纯化的PCR产物，150ul
● 10X限制性内切酶缓冲液，20ul
● 限制性内切酶（10U/ul），5ul
3．在适当的温度消化2小时。
C.对扩增和消化的cDNA片段按大小进行分馏并重新获得cDNA片段
1．在0.8%（w/v）琼脂糖/TAE凝胶（允许电压为1～5V/cm）上纯化限制酶的消化产物。
2．用无菌刀小心地切除靶区域（500～3000bp），将凝胶片转移到15ml的聚丙烯管中。注意：增加了跑胶时间会导致靶区域的扩大。
3．用Geneclean或WizardPCRDNA预纯化系统来纯化琼脂糖凝胶分离的片段，在50ul的水中重新得到扩增的cDNA。
4．用DNA浓度测量试剂盒来估计DNA的浓度。
