[器材和试剂]
● ABl 377型测序仪
● ABI的BigDye染液
● ABl 9700型PCR仪器
● ABI蓝色葡聚糖/EDTA上样缓冲液
● 3mol/L的乙酸钠
● 95％及70％的乙醇
● 0．4pmol/ul的fUSE5“超级反向”引物，或T7“超级上游”引物
● 一台带Qiagen 2X 96平板转子或同等转子的Qiagen 4K15C型离心机
[方法]
1．将测序反应成分混合于10ul的反应体积中：1．5ul来自PCR扩增的PCR产物， 2．5ul的MilliQ纯水，2．0ul浓度为0．4pmol/ul的{USE5“超级反向”引物或T7“超级上游”引物（共0．8pmol），4.0ul的Big Dye染液。
2．在以下条件下完成热循环：94℃放置2分钟；分别在3个温度下进行PCR，进行30次循环，分别是96℃下45秒、50℃下20秒以及60℃下3分钟；放置在4℃下直到准备纯化为止。
3．向10ul的测序反应体系中加入1ul 3mol/L乙酸钠和25ul 95％乙醇。
4．在-20℃下孵育60分钟以沉淀产物。
5．在带Qiagen 2X 96平板转子或同等转子的Qiagen 4K15C型离心机中，6000r/min（5788g） 离心20分钟。
6．迅速翻转96孔板，并将乙醇轻轻甩出。
7．用125ul的70％乙醇洗涤。
8．在带Qiagen 2X96平板转子或同等转子的Qiagen 4K15C型离心机中，6000r/mln离心5分钟。
9．迅速翻转96孔板，并将乙醇轻轻甩出。
10．在一个96孔加热板上干燥15分钟。
11．将样品悬浮于1．5ul的ABI蓝色葡聚糖/EDTA上样缓冲液中。
12．每份样品取0．8ul上样到一块预制的聚丙烯酰胺测序胶上，并在ABl 377测序仪上跑3．5小时。
13．用序列分析软件来分析数据，如SequencherTM（GeneCodesCorp）。
