通常说来，底物的浓度要远远小于它们各自酶切反应的Km值和酶的浓度，并且筛选应该在基于koat/KIn值的基础上进行。然而，在同一次噬菌体展示中，合成肽段的是cat值、Km值及kcat/Km．值有很大范围的不同。对多价底物噬菌体展示的反应动力学研究表明，底物切割是一个单指数事件（singleexponential event），底物结合是其中的限速步骤。
由于底物噬菌体展示筛选技术的实验本质，在利用文库筛选真正底物之前进行一系列的预实验是非常有必要和关键的。这样的阳性对照实验能够证明特异性的底物裂解能够在相应的文库连接序列前后和选定的实验条件下发生。在接下来的实验中就可以选择zui合适的酶的反应浓度以及筛选过程中zui合适的反应时间。需要注意的是，这些预实验必须包括两种底物噬菌体，一个带有已知的能够被切割的底物序列，一个带有已知的非底物序列。使用相同数量的底物和非底物噬菌体分别与亲和性结构域结合，之后加入要研究的蛋白酶进行酶切。通过测定从每个样本中释放的噬菌体的滴度，就可以推测出每轮筛选中噬菌体可以富集到的程度。另一种优化富集程序的方法是通过制备一系列不同的底物噬菌体门≥底物噬菌体的混合物[例如从1：103～106）]，从而模拟筛选过程。通过测定在每一轮筛选后得到的底物与非底物噬菌体的比值，我们可以预测到在某一固定底物浓度下的富集能力。
● 约lO12个菌落形成单位（cfu）的底物噬菌体阳性及阴性对照
● 浓度大于1012cfu/ml，约1012 cfu的文库底物噬菌粒
● 约1012个噬菌斑形成单位（pfu）的辅助噬菌体，例如M13K07（New EnglandBiolabs），或者VCSMl3（Strata gene）
● 约long捕获试剂（例如hGH结合蛋白、抗多肽抗体）
● 高亲和力96孔板，如Nunc Maxisorp板（Nalge Nunc）
● 新鲜的（小于1周）F’大肠杆菌，如XL-Blue的划线培养平板（Stratagene）
● 捕获试剂的固定缓冲液（例如50mmol/L碳酸盐缓冲液，pH 9．6）
● 含0．05％Tween—20的磷酸盐缓冲液（PBST）
● 适合要研究的蛋白酶的稀释及反应缓冲液
● 含2％脱脂牛奶的PBS
● 0．2mol/L*缓冲液，pH 2．0
● 1mol/LTris碱
● LB+100ug/ml氨苄*或LB+羧苄*的琼脂平板或液体培养基
● 2XYT培养基
● 低蛋白或无蛋白结合的微孔板（例如NalgeNunc 96F型聚丙烯酰胺板）
